In vivoイメージングによる唾液腺腺房細胞のカルシウム応答と分泌反応の解析

• Project/Area Number: 21791809
• Research Category: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Functional basic dentistry
• Research Institution: Health Sciences University of Hokkaido
• Principal Investigator: 根津 顕弘 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (00305913)
• Project Period (FY): 2009 – 2010
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2010)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2010: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2009: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
• Keywords: In vivo / 唾液腺細胞 / 細胞内Ca^<2+>動態 / 唾液分泌反応 / 細胞内分子動態 / イノシトール三リン酸(IP_3)

Research Abstract

平成22年度は、in vivoでのラット顎下腺におけるCa^<2+>応答の測定法の改良と、IP_3バイオセンサーLIBRAvの顎下腺への導入を行った。
ラット顎下腺開口部からCa^<2+>蛍光指示薬fura-2/AMを逆行性に注入し、顎下腺にfura-2を負荷した。Fura-2を負荷した顎下腺を蛍光顕微鏡で観察すると腺房および導管細胞を含めた組織全体に十分なfura-2蛍光が観察された。顎下腺局所に30G注射針を挿入しムスカリン受容体作動薬で刺激したところ、その投与した部位に大きなCa^<2+>の上昇が観察された。
IP_3感受性を向上した改良型LIBRAv(cLIBRAvIIs)発現プラスミドを作成し、そこからウイルスベクターを作製した。ウイルスベクターにより培養細胞に発現させたcLIBRAvIIsを精製し、IP_3に対する反応性を調べたところ、cLIBRAvIIsはLIBRAvに比べIP_3に対する感受性が2倍以上高いことが確かめられた。精製したcLIBRAvIIを単離腺房細胞に導入した。ムスカリン受容体作動薬により腺房細胞のcLIBRAvIIsの蛍光比上昇が観察された。cLIBRAvIIs発現ウイルスベクターをラット顎下腺に逆行性に注入し、顎下腺にcLIBRAvIIsの導入を試みた。その結果、舌下腺では蛍光は認められず、顎下腺のみにcLIBRAvIIsの蛍光が観察された。さらに顎下腺を酵素処理で単離したところ、腺房細胞にcLIBRAvIIsが発現していた。しかし発現の割合は10～20%と低かった。またウイルスベクターを導入した顎下腺では、組織に炎症は認められないものの、導入していない顎下腺と比べ唾液分泌量の40～50%程度の低下が認められた。Fura-2やcLIBRAvIIsウイルスベクターの導入方法を改良することで、より精度の高いin vivoでのCa^<2+>とIP_3動態やそれに応答する唾液分泌反応の解析が可能となると考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Visualization of Ins(1,4,5)P_3 dynamics in living cells : two distinct pathways for Ins(1,4,5)P_3generation following mechanical stimulation of HSY-EA1 cells. (2010)
  • Author(s): Nezu A., et al.
  • Journal Title: Journal of Cell Science Volume: 123 Pages: 2292-2298
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 細胞質発現型IP_3バイオセンサーの分離精製と耳下腺腺房細胞への導入 (2011)
  • Author(s): 根津顕弘, 他
  • Organizer: 第84回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県)
• [Presentation] Na^+-K^+-2Cl^-共輸送体のタンパク質発現に必須なアミノ酸配列の同定 (2010)
  • Author(s): 根津顕弘, 他
  • Organizer: 第38回薬物活性シンポジウム
  • Place of Presentation: 札幌市教育文化会館(北海道)
  • Year and Date: 2010-10-07
• [Presentation] 唾液腺への非侵襲的アデノウイルス注入によるStim1のin vivo発現と機能解析 (2010)
  • Author(s): 森田貴雄、谷村明彦、設楽彰子、根津顕弘, 他
  • Organizer: 第61回日本薬理学会北部会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター(北海道)
  • Year and Date: 2010-09-10
• [Presentation] 機械刺激による細胞内IP_3動態の可視化:HSY-EA1細胞における機械刺激を介した2つのIP_3産生経路 (2010)
  • Author(s): 根津顕弘, 他
  • Organizer: 第24回北海道薬物作用談話会
  • Place of Presentation: 北海道大学(北海道)
  • Year and Date: 2010-07-24
• [Presentation] アデノウイルスを使った蛍光標識分子のin vivoでの発現と機能解析 (2010)
  • Author(s): 森田貴雄、谷村明彦、設楽彰子、鈴木裕子、根津顕弘, 他
  • Organizer: 北海道医療大学歯学会第28回学術大会
  • Place of Presentation: 北海道医療大学サテライトキャンパス(北海道)
  • Year and Date: 2010-03-06
• [Presentation] 唾液腺細胞に発現させたStim1-mKO1によるCa^<2+>応答の増強 (2010)
  • Author(s): 森田貴雄、谷村明彦、設楽彰子、根津顕弘, 他
  • Organizer: 第52回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀(東京都)
• [Presentation] Use of FRET-based IP_3 biosensors LIBRAv for the quantitative measurement of IP_3 dynamics in living cells and detection of novel IP_3R ligands. (2010)
  • Author(s): Tanimura A., Nezu A., et al
  • Organizer: The 16^<th> Takeda Science Foundation Symposium on Bioscience Organizing
  • Place of Presentation: シェラトン都ホテル東京(東京都)
• [Presentation] 機械刺激による細胞内IP_3動態の可視化 (2010)
  • Author(s): 根津顕弘, 他
  • Organizer: 第83回日本薬理学会総会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場(大阪府)
• [Presentation] Ca^<2+>オシレーションに伴うIP_3動態の定量的解析 (2009)
  • Author(s): 谷村明彦、森田貴雄、根津顕弘、東城庸介
  • Organizer: 第60回日本薬理学会北部会
  • Place of Presentation: 富山国際会議場(富山県)
  • Year and Date: 2009-09-26
• [Presentation] Monitoring of IP_3 dynamics during the mechanical stimulation-induced intra- and intercellular Ca^<2+> waves in HSY human parotid cell line. (2009)
  • Author(s): Akihiro Nezu, et al.
  • Organizer: 11^<th> International Symposium on Exocrine Secretion
  • Place of Presentation: 徳島大学(徳島県)
• [Presentation] Monitoring of IP_3 dynamics during Ca^<2+> oscillations in HSY human parotid cell line with FRET-based IP_3 biosensors. (2009)
  • Author(s): Akihiko Tanimura, Takao Morita, Akihiro Nezu, et al.
  • Organizer: 11^<th> International Symposium on Exocrine Secretion
  • Place of Presentation: 徳島大学(徳島県)
• [Presentation] 細胞質発現型IP_3バイオセンサーの精製とそれを用いた耳下腺腺房細胞のIP_3濃度測定への応用 (2009)
  • Author(s): 根津顕弘, 他
  • Organizer: 第51回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ(新潟県)
• [Presentation] 唾液腺へのアデノウイルス注入による蛍光標識分子の生体内発現と細胞内局剤の解析 (2009)
  • Author(s): 森田貴雄、谷村明彦、設楽彰子、根津顕弘, 他
  • Organizer: 第51回歯科基礎医学会学術大会・総会
  • Place of Presentation: 朱鷺メッセ(新潟県)