バイオプローブによる細胞核内動的秩序構造の基本原理探索

Research Project

Project/Area Number	21H01051
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Basic Section 13040:Biophysics, chemical physics and soft matter physics-related
Research Institution	Toyo University
Principal Investigator	藤井修治東洋大学, 食環境科学部, 教授 (40401781)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥16,510,000 (Direct Cost: ¥12,700,000、Indirect Cost: ¥3,810,000) Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2022: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2021: ¥11,050,000 (Direct Cost: ¥8,500,000、Indirect Cost: ¥2,550,000)
Keywords	細胞核 / バイオプローブ / 秩序構造 / 共焦点レオロジー / 動的秩序構造 / 染色体 / 粘弾性
Outline of Research at the Start	細胞核内部では、遺伝子の転写・複製・修復が行われている。これらの活動には染色体の高次構造が強く関係する。この染色体の高次構造は、遺伝子疾患・癌化・細胞死にも深く関係することが明らかになりつつある。このため、染色体の構造秩序を調べることは物理学的・医学的に重要な課題である。染色体の構造秩序は、生理的な運動により大きく変形する細胞核内においても常に維持されると考えられるが、なぜ構造秩序を乱すような大変形下においてクロマチンの動的構造秩序が維持されるのか、そのメカニズムは明らかではない。本研究では、応力場における細胞核内部の構造体の運動を調べ、構造秩序を維持する基本原理を明らかにする。
Outline of Annual Research Achievements	目的はバイオプローブを用いて細胞核内部のダイナミクスを調べることである。特に、静止場と応力場におけるバイオプローブのダイナミクスを基に、変形が与える核内ダイナミクスへの寄与を明らかにする。バイオプローブ(FtH)を細胞核内に発現した細胞(HeLa)にプローブの自己会合体形成を促進させる酸化剤(2,3’-Dipyridyldisulfide )を加えてタンパク質自己会合体形成を促進させ、形成された自己会合体の拡散挙動を解析した。自己会合体は100nm程度の大きさである。平均自乗変位の時間依存性より、そのべき乗則の指数が3つの時間領域に分類できることを確認した。また当初の計画にはなかったが、細胞核内部で光誘起型の液-液相分離を示すRNA結合タンパク質(FUS)の拡散ダイナミクス解析を実施した。水銀ランプを光源とする蛍光顕微鏡上でフィルターを介して青色光を細胞に照射し、液液相分離によりFUSの球状ドメインが形成されたところで、球状ドメインの拡散挙動を解析した。球状ドメインは数マイクロメートルまで成長し、時間経過とともにオストワルドライプニングによりさらに合体・成長する。そのため限られた時間帯ではあるが、sub-diffusionを示すことを確認した。ただしドメインサイズが大きいためか、平均自乗変位のべき乗則の指数のクロスオーバーは見られなかった。核内ダイナミクスを検出するためのバイオプローブとしては前者の方が適切である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 1年目の遅れを引きずっていることが遅れの原因であるが、それに加え、2年目では画像取得ソフトMataMorphの販売停止に伴う購入ソフトの再選定でも時間を要した。当初計画ではMetaMorphを使用して対物レンズのピエゾ制御を行う予定であった。そのため6月時点からメーカーと打ち合わせを重ねソフトとピエゾ&ドライバーの動作確認をすることにより数ヶ月に渡って購入の準備を進めていたが、急遽販売停止の連絡を受け機器選定を全て白紙状態から行うこととなり、大幅にソフトウェアの導入が遅れたことも遅れの原因となった。一方、牽引力顕微鏡を作成したことにより、従来の予定にはなかった細胞の牽引力計測と核内部のダイナミクスとの比較が可能になったことは進展の一つである。今後、ゲルに閉じ込めた細胞に応力を加え、外的応力により細胞自身がどの程度の力を発生させ基板に留まるのか検討することが可能になった。また、その際、細胞が作り出す力と細胞核の変形との因果関係を調べることができる。
Strategy for Future Research Activity	外力下における細胞核の変形と核内バイオプローブの拡散挙動を調べる。コラーゲンゲル中に細胞(HeLa)を閉じ込め、ゲルを変形させることにより細胞に応力を加え歪ませる。この際の細胞核の変形と核内部の核小体やバイオプローブの拡散挙動を顕微観察し、外力が核内ダイナミクスに及ぼす影響を調べる。加えて、牽引力顕微鏡を利用し、外力下において細胞が作り出す牽引力を計測する。この時、細胞核まわりにおける牽引力に注目し、細胞自身の牽引力が細胞核の変形に与える影響を調べ、細胞変形と核の変形との関係を明らかにする。これにより細胞変形・核の変形・核内ダイナミクスの階層的なダイナミクスを調べる。同様の実験を、ATP枯渇系でも実施する。