未培養微小真核生物群の生態・機能解明による活性汚泥食物環モデルの再構築

• Project/Area Number: 21H01460
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 22060:Environmental systems for civil engineering-related
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 久保田 健吾 東北大学, 環境科学研究科, 准教授 (80455807)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山田 剛史 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (90533422)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000); Fiscal Year 2023: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2022: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000); Fiscal Year 2021: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
• Keywords: 活性汚泥 / 微生物群集

Outline of Research at the Start

我々の生活から出る汚水は主に微生物によって処理されているが、その処理を担っている微生物、特に微小真核生物については殆どわかっていない。近年の培養によらない解析によって、これまで多くの微小真核生物が見逃されてきたことが明らかになりつつある。本研究は、その未知微小真核生物の生理・生態を明らかにすることで、活性汚泥における食物環モデルを再構築することを目的として行う。

Outline of Annual Research Achievements

選抜したサンプルについてメタゲノム解析を行った。ショートリードシーケンシングおよびナノポアロングリードシーケンシングを行い、コンティグを作成した。コンティグ作成時には、標的とする真核生物が存在する汚泥を用いたコアセンブリを行った。真核生物に着目した解析を行うために、コンティグの中から真核生物由来と思われるものをスクリーニングし、抽出した。抽出されたコンティグのみを用いてビニングを複数のソフトを用いて行ったところ、数Mbpのビンを含むビンが得られた。それらに対して真核生物の遺伝子マーカーを用いて解析を行ったところ、標的とする微小真核生物由来と思われるビンをいくつか回収することができた。標的とする微小真核生物はFungiに属するため、Fungiのゲノムツリーを参照し、そこで使われている1つの遺伝子マーカーを用いて系統樹を作成したところ、Cryptomycotaに近縁な遺伝子を有していることがあきらかになった。従って、今回回収することができたビンは標的とする微小真核生物由来のものである可能性が高いことがわかった。
また標的とする微小真核生物を視覚的に検出するためにrRNAの異なる領域に結合する2つのFISHプローブを適用した。その結果、どちらか一方のプローブで検出される微生物群は存在するものの、両方のプローブで検出される微生物は検出されなかった。FISH法による特異的な検出にはさらなる検討が必要であることが考えられる。また存在割合が低いとメタゲノム解析、FISH解析ともに難しくなるため、バイオリアクターを用いた集積培養が必要であるといえる。
また様々なリアクターにおける標的とする微小真核生物の存在を調べるために、アンプリコンシーケンス解析を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

FISH法による検出はできなかったものの、生息環境調査や標的とする微小真核生物由来のビンを回収できるなど概ね順調に進捗している。

Strategy for Future Research Activity

集積培養により標的とする微小真核生物を培養し、メタゲノム解析およびFISH解析を行うとともに、生息環境調査を継続して行う。

Research Products

• [Int'l Joint Research] The University of Queensland(オーストラリア)
• [Journal Article] Propidium monoazide - polymerase chain reaction reveals viable microbial community shifts in anaerobic membrane bioreactors treating domestic sewage at low temperature (2023)
  • Author(s): Ni Jialing、Ji Jiayuan、Li Yu-You、Kubota Kengo
  • Journal Title: Bioresource Technology Volume: 387 Pages: 129564-129564
  • DOI: 10.1016/j.biortech.2023.129564
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Microbial community and the core microbiome of activated sludge treating sewage in Japan (2022)
  • Author(s): 久保田 健吾、佐藤 幹子、加藤 裕之、李 玉友
  • Journal Title: Journal of Japan Sewage Works Association Volume: 59 Issue: 717 Pages: 132-140
  • DOI: 10.24748/jswa.59.717_132
  • ISSN: 0021-4639, 2434-2475
  • Year and Date: 2022-07-01
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Diversity of <i>Candidatus</i> Patescibacteria in Activated Sludge Revealed by a Size-‍Fractionation Approach (2022)
  • Author(s): Kagemasa Shuka、Kuroda Kyohei、Nakai Ryosuke、Li Yu-You、Kubota Kengo
  • Journal Title: Microbes and Environments Volume: 37 Issue: 2 Pages: n/a
  • DOI: 10.1264/jsme2.ME22027
  • ISSN: 1342-6311, 1347-4405
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Metagenomic analysis of novel fungi in sewage treatment processes (2023)
  • Author(s): Kubota, K., Robbins, S., Dougan, K., Urasaki, K., Sato, M., Li, Y.-Y., Chan, C.X. and Hugenholtz, P.
  • Organizer: 10th IWA Microbial Ecology and Water Engineering Specialist Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Evaluation of microbial community in anaerobic N2O reducing bioreactor (2023)
  • Author(s): Maeda, R., Satoh, M., Kubota, K.
  • Organizer: 10th IWA Microbial Ecology and Water Engineering Specialist Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Diversity of candidate phylum Patescibacteria in activated sludge as revealed by amplicon and metagenomic analyses (2022)
  • Author(s): Shuka Kagemasa, Kyohei Kuroda, Ryosuke Nakai, Yu-You Li, Kengo Kubota
  • Organizer: 18th International Symposium on Microbial Ecology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 薬剤製造廃水処理における微生物群集構造の変遷 (2022)
  • Author(s): 泉偲緒里, 江口拓, 安本さいか, 李玉友, 佐藤幹子, 久保田健吾
  • Organizer: 第56回日本水環境学会
• [Presentation] サイズ分画とメタゲノムによる活性汚泥中のPatescibacteriaの機能解析 (2022)
  • Author(s): 景政柊蘭, 黒田恭平, 中井亮佑, 李玉友, 久保田健吾
  • Organizer: 第56回日本水環境学会
• [Presentation] Strategy for metagenomic analysis of Patescibacteria in activated sludge (2021)
  • Author(s): Shuka Kagemasa, Kyohei Kuroda, Ryosuke Nakai, YU-You Li, Kengo Kubota
  • Organizer: WET (Water and Environment Technology Conference) 2021
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 活性汚泥中に存在しているPatescibacteriaの多様性と代謝特性 (2021)
  • Author(s): 景政柊蘭, 黒田恭平, 中井亮佑, 李玉友, 久保田健吾
  • Organizer: 第24回水環境学会シンポジウム