| Project/Area Number |
21H01754
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 28030:Nanomaterials-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究院, 名誉教授 (40311518)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾瀬 農之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (80380525)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
Fiscal Year 2021: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
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| Keywords | 結晶核形成 / タンパク質 / BLLナノ構造 / 核剤 / 相転移 |
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| Outline of Research at the Start |
タンパク質の結晶化には、基本的に大量な試行錯誤での条件探索が必要であり、タンパク質結晶構造解析法のボトルネック技術となっている。申請者は金属有機構造体の繰返し構造を利用したタンパク質結晶核形成技術を研究し、バランスト・ラティス・レッジ (BLL) と名付けたナノ構造がタンパク質の結晶核形成に非常に有効であることを見出した。本研究では、BLLナノ構造を持つ核剤が誘発する、タンパク質の「液液相分離を経た液結晶相転移メカニズム」を研究することによって、より汎用性のある有効な核剤の設計法を開発し、構造生物学分野だけではなく、医学や材料科学分野にも波及する結晶核形成過程制御技術の開拓をめざす。
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の結晶核形成は、低頻度で制御困難なタンパク質溶液－結晶相転移過程を経て進む。その核形成過程は、タンパク質分子の形態学上の複雑性（多様なサイズ、不規則な形状、様々な表面電荷、表面形状の動的な特徴など）に依存する。そのためタンパク質の結晶化は、結晶構造解析技術が非常に速い勢いで発展している現在においても、依然として越えなければならない大きな壁として立ちはだかっている。
本研究では、我々が開発したBLLナノ構造を持つ核剤がタンパク質分子の配列規則性を誘発し、分子の自己組織化・結晶性パッキングを引き起こす過程（溶液－結晶相転移過程）を促進するメカニズムを解明する。核剤の設計に理論的な基盤を提供することで、より汎用性のある有効なタンパク質結晶化の核剤の設計・創製を可能にし、溶液－結晶相転移の制御を実現することを目指す。
本研究の目的を達成するため、2022年度は、１．促進メカニズムについて、既に開発しているBLL核剤の破壊処理と使用方法の検討を行った。その際、標準サンプルLysozymeとGatCABを用いて、2021年度に得られた核形成効果を速く簡単に検証できる方法、すなわちタンパク質結晶化溶液の過飽和相の測定によって結晶核形成効果を検証した。その結果、破壊処理の条件を確定し、結晶化プレートにコーティングするよりも、BLL水溶液とタンパク質溶液の混合が効果的であることも分かった。また、新規の結晶性核材の候補を選択し、合成を始めた。
２．BLL核剤の汎用性について、当研究室の結晶化に困難なサンプルについてBLLを適用した。そのうち、膜タンパク質BcsC-Cの初期結晶（12Å回折能）を得た。ウイルス感染の免疫防疫のタンパク質とAODの結晶が構造解析できるまでには改善できなかった。原因の一つに、使用した低い濃度のタンパク質量が核形成後の結晶成長に不十分と考えられ、今後、結晶成長方法の検討も必要である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画した「１．促進メカニズムについて」および「２．BLL核剤の汎用性について」、ほぼ計画通りに完成した。特に、2021年度に、核形成効果を速く簡単に検証できる方法（タンパク質結晶化溶液の過飽和相の測定）を得られ、Cryo-EM、あるいはHS-AFMを用いた観察より迅速かつ簡単に、低コストで核形成効果を確認することができた。よって、2022年度に、その方法に従って、既に開発しているBLL核剤の破壊処理、および使用方法の検討ができた。また、低分子結晶構造データベースCSDおよび論文から、新規の結晶性核材の候補を選択し、合成を始めた。さらに、合成方法も検討し、10種類以上の新規結晶性核材の合成を可能にした。
BLL核剤の汎用性について、2021年度に引き続き、当研究室の結晶化に困難なサンプルについてBLLを適用した。そのうち、膜タンパク質BcsC-Cの初期結晶（12Å回折能）を得た。また、BLLを用いた低濃度のタンパク質溶液の使用は、結晶の成長に影響があることも見出して、良質な結晶を得ることについての対策の検討を始めた。
よって、おおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、核剤表面のBLLナノ構造が誘発するタンパク質の溶液－結晶相転移メカニズムを明らかにし、核剤によるタンパク質の溶液－結晶相転移の制御を実現することを目的とする。そのために、今後は以下の計画でBLLナノ構造による結晶核形成の促進メカニズム、BLL核剤の汎用性、他のBLL核剤の研究を進めて行く。
１．促進メカニズムについて：2022年度に、既に開発していたBLL核剤の破壊処理によって、レッジ効果の確認、および結晶化効果の検証ができた。よって、2023年度は主に、ケンブリッジ結晶構造データベースCSDや、論文から選択した結晶性材料を合成し、TEMを用いてレッジの確認、そして標準サンプルの結晶化効果の検証を行う。また、結晶性材料のラティスサイズを10-50Åの数種類選び、ラティスサイズの影響を検証する。
2022年度に材料の合成方法を確立したので、今後10個以上の材料の合成は可能であり、結晶化標準サンプルは、2022年度と同様に市販のLysozyme/Trypsin、大量調製が確立しているグルタミンアミドトランスフェラーゼGatCAB複合体を使用する。
２．BLL核剤の汎用性について：2022年度に引き続き、BLLリッチな核剤を用いて、結晶化に困難なサンプルの結晶化を行い、BLLリッチな核剤の汎用性を確認する。サンプルは当研究室で調製したタンパク質だけではなく、他の研究グループのサンプルまで適用する。
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