Development of analytical method for DNA hydroxymethylcytosine and biological significance of hemi-modification of cytosine.

Research Project

Project/Area Number	21H02154
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Basic Section 38060:Applied molecular and cellular biology-related
Research Institution	University of Yamanashi
Principal Investigator	幸田尚山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (60211893)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	志浦寛相山梨大学, 大学院総合研究部, 助教 (10451907)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000) Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2022: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000) Fiscal Year 2021: ¥8,970,000 (Direct Cost: ¥6,900,000、Indirect Cost: ¥2,070,000)
Keywords	ヒドロキシメチルシトシン / メチルシトシン / エピゲノム解析
Outline of Research at the Start	我々はメチルシトシン(mC)の脱メチル化反応に関わることが明らかになったヒドロキシメチルシトシン(hmC)を、mCや非修飾のシトシン(C)と同時に解析する独自の手法の開発を行ってきた。本研究ではこの手法の解析精度を高め、さらにこれまで開発した手法では片鎖ずつしか解析できなかったものを、DNAの2本鎖を同時に解析が可能になるよう改良を加え、CpGの3種類の「ヘミ修飾」すなわちヘミメチルシトシン(mC/C)ヘミヒドロキシメチルシトシン(hmC/C)及び片鎖がmC逆鎖がhmCの状態(mC/hmC)も含めてCpGの全ての修飾状態を解析可能とし、新しいエピゲノム解析の手法として提案する。
Outline of Annual Research Achievements	我々はメチルシトシン(mC)の脱メチル化反応に関わることが明らかになったヒドロキシメチルシトシン(hmC)を、mCや非修飾のシトシン(C)と同時に高精度に解析する独自の手法をEnIGMA (Enzyme-assisted Iden- tification of Genome Modification Assay) 法と名付け、開発を行ってきた。本研究ではこの手法の解析精度を高めた上でゲノムワイド解析にも耐えられるよう改良する。これに加えてこれまでは片鎖ずつしか解析できなかった手法を、DNAの2本鎖を同時に解析が可能になるよう改良を行い、あまり考慮されてこなかった「ヘミ修飾」も含め、シトシン修飾の生物学的意味を明らかにすることを目指している。すでに我々が開発してきたEnIGMA法では哺乳類のDNAメチル化酵素であるDNMT1の持つ基質特異性を用いてmC、hmCおよびCを同時に解析することを可能とした。それぞれのシトシンの修飾状態に対してその解析精度は95%程度と他のhmC解析技術と同程度の精度で修飾状態を同定できることが示されている。初年度においてはmC、hmCを持つ合成DNAをモデル基質として作成し、新たに考案した酵素反応の組み合わせによってmC、hmCおよびCの同定が可能であることを確認した。また、種々の反応条件の至適化を開始し、十分に高い精度での解析が可能となるよう実験条件の設定を試みるとともに、実際にマウスのゲノムを用いても同様に解析が可能であるか、EnIGMAver.1とver.2とを比較しながら検討を開始した。２年度目はさらに改良を加えて両鎖の修飾状態を同時に解析する手法の開発を開始した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason これまで開発したEnIGMA法(ver.1)から、解析精度をさらに上げてゲノムワイドの解析にも十分に適用できるように新しく考案した酵素反応の組み合わせによってmC、hmCおよび非修飾のシトシンの同時同定を行う手法をEnIGMA ver.2として確立した。さらにこの新しく考案した手法に改良を加えて２本鎖DNAの両鎖の修飾状態を同時に解析する手法をEnIGMA ver.3として開発を開始し、種々の条件検討を行なっている。EnIGMA ver.3ではver.1、ver.2と比較してより長いヘアピン状のDNAを変性する必要があるため、その条件の設定を進めているところである。また、最終的に必要となるシーケンス長も２倍になるため、次世代シーケンサーによる解析に用いるシーケンスプライマーにも工夫が必要であることが明らかとなったため、用いるアダプターの配列について新たな検討を加えているところである。
Strategy for Future Research Activity	２本鎖DNAの両鎖の修飾状態を同時に解析する手法としてEnIGMA ver.3を開発しているが、ver.3ではver.1、ver.2と比較してより長いヘアピン状のDNAを変性する必要があるため、種々の酵素を働かせることができる比較的温和な条件下での変性が必要である。最近、UvrD helicaseを用いてヘアピン状のDNAを変性する手法の報告があったため、これを用いて変性条件の検討を行っている。また、最終的に必要となるシーケンス長も２倍になることや、シトシンのデアミネーションの結果ホモポリマー配列が増えてしまうため、Illumina社の次世代シーケンサーによるpair-endの解析を行う場合に困難が生じる可能性が新たに明らかになった。このため、用いるシーケンスプライマーにも工夫が必要であると考えており、ライブラリ調整時に用いるアダプターの配列やシーケンス用のプライマー配列について新たな検討を加えることで問題点を解決することを計画している。