Structural basis of activation of a novel tumor progression signaling involving Wnt signaling proteins and supression by antibodies.
Project/Area Number |
21H02420
|
Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
|
Allocation Type | Single-year Grants |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
|
Research Institution | University of Hyogo |
Principal Investigator |
柴田 直樹 兵庫県立大学, 理学研究科, 准教授 (30295753)
|
Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
|
Budget Amount *help |
¥13,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000、Indirect Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2021: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000)
|
Keywords | X線構造解析 / 単粒子解析 / CKAP4 / Dikkopf / モノクローナル抗体 / 構造生物学 / Wntシグナル伝達経路 / 結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡 / 癌 / がん / 抗体 / シグナル伝達 |
Outline of Research at the Start |
Dickkopf (DKK)は,細胞分化などを制御するカノニカルWntシグナルにおける細胞外因子の1つであるが,Cytoskeleton-associated protein 4 (CKAP4)にも結合し,癌細胞増殖シグナルを活性化する。DKK/CKAP4シグナルは膵癌などにおいて60%以上の患者で高発現し,予後を悪化させる。一方,腫瘍抑制効果を発揮する抗CKAP4抗体はDKK/CKAP4シグナルを抑制するが,その分子機構は未解明である。本研究ではDKK,CKAP4,抗CKAP4抗体が構築する複合体の構造解析によって,シグナル活性化や抗CKAP4抗体が抗腫瘍効果を発揮する理由を解明する。
|
Outline of Annual Research Achievements |
R4年度は,研究計画調書に記した4項目のうち主に以下の3項目,① CKAP4-DKK複合体の構造解析,② CKAP4細胞外領域全体の構造解析,③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析について研究を遂行した。以下にこれまでの結果について概要を示す。 ① CKAP4とDKK cysteine rich domain (DKK_CRD1)試料をそれぞれ別々に調製したものを混合し結晶化スクリーニングキットを用いて結晶化条件の検討を行ったところ,1条件において結晶が得られた。 ② CKAP4細胞外領域(128-602)のうち,431-602の領域について新たに発現系を構築し,結晶を得ることができた。放射光施設において回折実験を行ったところ,約 4オングストローム分解能のデータを得ることに成功した。 ③ 4種類の抗CKAP4モノクローナル抗体のFabフラグメントとCKAP4細胞外領域との複合体を調製した。結晶化スクリーニングを行うために十分な量の複合体試料を得ることが困難であったため,結晶構造解析法よりも少量での構造解析が可能なクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して測定を行った。その結果,ほとんどの粒子がグリッド上で気液界面に集合していることが判明した。得られた画像データから単粒子解析を行ったが,明瞭な三次元再構成像を得ることが困難であった。二次元でのクラスタリングではCKAP4-Fab複合体と思われる像が得られたため,グリッド作成法の検討により明瞭な三次元再構成像を得ることは可能であると思われる。
|
Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①~③の各項目について,現時点における研究全体に対する達成度は以下の通りである。 ① CKAP4-DKK複合体の構造解析(60%) ② CKAP4細胞外領域全体の構造解明(80%) ③ CKAP4-抗体フラグメント複合体の構造解析 (50%) 以上を総合すると60%以上まで到達しており,全体的には概ね計画通りに進行していると判断できる。
|
Strategy for Future Research Activity |
①~③の各項目について,研究の進捗状況をふまえ,以下の方針で研究を進めていく。 ①当該年度中にDKK-CRD1ドメインとCKAP4細胞外領域の複合体の結晶が得られたので,放射光施設においてX線回折データ測定し,DKK-CKAP4複合体の立体構造解析を行う。一方で,得られた結晶からは中~高分解能のX線回折データを得ることが困難な場合を想定し,引き続いてクライオ電子顕微鏡による単粒子解析も並行して実施する。これによってDKKとCKAP4の相互作用について詳細を明らかにし,LRP5/6を含めた三者複合体モデルを構築する。 ②CKAP4細胞外領域の構造解析はほぼ完了したが,まだ側鎖の構造が不明な領域があるため,引き続き結晶化条件の改良に取り組む。 ③当該年度末までに4種類の抗CKAP4モノクローナル抗体のFabフラグメントとCKAP4細胞外領域との複合体を調製した。結晶化スクリーニングを行うために十分な量の複合体試料を得ることが困難なため,結晶構造解析法よりも少量での構造解析が可能なクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を目指して測定を行った。その結果,ほとんどの粒子がグリッド上で気液界面に集合していることが判明した。得られた画像データから単粒子解析を行ったが,明瞭な三次元再構成像を得ることが困難であった。次年度は界面活性剤を用いて粒子を液相全体に分散させることにより,高分解能での三次元再構成像を得ることを目指す。
|
Report
(2 results)
Research Products
(3 results)
-
-
[Journal Article] X-ray crystallographic and mutational analysis of the NylC precursor: catalytic mechanism of autocleavage and substrate hydrolysis of nylon hydrolase2023
Author(s)
Seiji Negoro, Naoki Shibata, Dai-ichiro Kato, Yusuke Tanaka, Kengo Yasuhira, Keisuke Nagai, Shohei Oshima, Yoko Furuno, Risa Yokoyama, Kaito Miyazaki, Masahiro Takeo, Kowit Hengphasatporn, Yasuteru Shigeta, Young-Ho Lee, Yoshiki Higuchi
-
Journal Title
FEBS journal
Volume: -
Issue: 13
Pages: 3400-3421
DOI
Related Report
Peer Reviewed
-