Structural basis of the flagellar axial structure and its construction
Project/Area Number |
21H02443
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Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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Allocation Type | Single-year Grants |
Section | 一般 |
Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
今田 勝巳 大阪大学, 大学院理学研究科, 教授 (40346143)
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Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2021: ¥8,060,000 (Direct Cost: ¥6,200,000、Indirect Cost: ¥1,860,000)
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Keywords | 細菌べん毛 / シンメトリーミスマッチ / クライオ電子顕微鏡 / 分子進化 / X線結晶構造 / 超分子複合体 |
Outline of Research at the Start |
細菌の多くは、べん毛と呼ばれる繊維状の運動器官を用いて移動する。べん毛は約30 種類の蛋白質が数万個集合した巨大な分子複合体である。べん毛基部のモータがロッド、フック、フィラメントで構成される繊維状の軸構造体を回転することで細菌は運動する。本研究では、短繊維べん毛の構造をクライオ電子顕微鏡法により解明し、物性・機能・構造・シンメトリーが異なるロッド・フック・フィラメントがどのように結合し、巨大な軸構造が一体で作動するしくみの理解を目指す。また、軸構造形成途中の様々なべん毛の構造を解析し、シンメトリーミスマッチを克服・利用して複雑な軸構造が形成されるしくみを解明する。
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Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細菌べん毛軸構造形成中間体と短繊維べん毛の構造をクライオ電子顕微鏡によりロッド-フック結合部、フック-フィラメント結合部の構造と、各部の成長端の構造を解明し、物性・機能・構造・シンメトリーが異なる領域を結合して巨大な軸構造が一体で作動するしくみとシンメトリーミスマッチを克服・利用して複雑な構造を形成するしくみの解明を目指している。今年度の実績は以下の通りである。 1)フィラメント欠損変異体からジャンクション中間体べん毛を単離精製し、クライオ電子顕微鏡像の単粒子解析を行った。前年度までに得た4 A分解能密度図はキャップに不鮮明な場所があったため、再度解析をやり直した結果4.44 Aでの解析に成功した。その結果、ジャンクション上の5量体キャップの段差の位置がフィラメント上の5量体キャップの段差の位置と異なること、キャップの末端の形態もフィラメント上とジャンクション上で異なることが明らかになった。 2)FlgK蛋白質欠損変異体を用い、FlgDキャップが結合した状態で成長が停止したべん毛試料を単離精製し、クライオ電子顕微鏡単粒子解析を行った。その結果、FlgDキャップ-フック結合部の5.5 A分解能密度図の作成に成功し、FlgDキャップの結晶構造とフックの電子顕微鏡構造を当てはめてモデルを構築した。その結果、FliDキャップとは全く異なる結合の仕方をすることが明らかになった。一方で、分解能が十分ではないため、高分解能構造を目指して、クライオ電子顕微鏡による撮影を継続した。 3)べん毛MotA複合体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、3.4 Aでの解析に成功した。MotAのみでも固定子複合体と同様の複合体を形成することを証明した。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度までにフラジェリンの発現を制御できる変異体を用から精製した短繊維べん毛試料のクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、FliDの結晶構造とフィラメントのクライオ電子顕微鏡構造を合わせることで、FliDキャップ-R型フィラメント結合部の構造を8 A分解能で解明した。また、フィラメント欠損変異体からジャンクション中間体べん毛を単離精製してクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、FliDキャップ-ジャンクション結合部の約4 A分解能の密度図を得た。さらに、FlgK蛋白質欠損変異体からFlgDフック中間体べん毛を単離精製し、クライオ電子顕微鏡による撮影を開始した。2022年度は、ジャンクション中間体のクライオ電子顕微鏡単粒子解析をやり直すことで不鮮明な箇所のない密度図の作成に成功し、FliDキャップ-ジャンクション結合部の構造を4.44 A分解能で解明した。また、FlgK蛋白質欠損変異体から精製したべん毛試料のクライオ電子顕微鏡単粒子解析を行い、FlgDキャップの結晶構造とフックのクライオ電子顕微鏡構造を合わせることでFlgDキャップ-フック結合部の5.5 A分解能での解析に成功した。しかし、モデルに曖昧な場所が残っているため、クライオ電子顕微鏡による撮影を継続し、高分解能での解析を進めている。
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Strategy for Future Research Activity |
今後は以下の項目を進める。 1)FlgDキャップが結合した状態で成長が停止したべん毛試料のクライオ電子顕微鏡撮影を継続し、FlgDキャップ-フック結合部の高分解能構造を解明する。そして、FliDキャップ-フィラメント結合部の構造と比較し、成長端の共通点と相違点を解明する。 2)短繊維試料の作成条件を改良してクライオ電子顕微鏡撮影を継続し、FliDキャップ-フィラメント結合部の高分解能化とフック-ジャンクション-フィラメント結合部の解析を実施する。 3)FlgJキャップが結合した状態で成長が停止したべん毛試料の作成とクライオ電子顕微鏡撮影を実施し、ロッド中間体の実態を解明する。 4)タグを用いて強アルカリ処理を用いない精製法を確立し、各成長中間体の精製に用いる。
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Report
(2 results)
Research Products
(14 results)
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[Journal Article] Structure of MotA, a flagellar stator protein, from hyperthermophile2023
Author(s)
Tatsuro Nishikino, Norihiro Takekawa, Duy Phuoc Tran, Jun-ichi Kishikawa, Mika Hirose, Sakura Onoe, Seiji Kojima, Michio Homma, Akio Kitao, Takayuki Kato and Katsumi Imada
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Journal Title
Biochemical and Biophysical Research Communications
Volume: 631
Pages: 78-85
DOI
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Peer Reviewed
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