| Project/Area Number |
21H02452
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
津下 英明 京都産業大学, 生命科学部, 教授 (40299342)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川野 竜司 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (90401702)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥13,000,000 (Direct Cost: ¥10,000,000、Indirect Cost: ¥3,000,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2021: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
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| Keywords | 二成分毒素 / タンパク質膜透過機構 / クライオ電子顕微鏡 / 電気生理 / ADPリボシル化 / ディフィシル菌 / タンパク質膜透過 / アンフォールディング / クライオ 電子顕微鏡 / 動的構造解析 / 膜孔形成毒素 / トキシン透過システム |
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| Outline of Research at the Start |
クロストリジウムが持つ二成分毒素の共通のタンパク質膜透過機構を明らかにする。二成分毒素はアクチンを特異的ADPリボシル化する毒素Iaとこれを細胞内へ膜透過させる装置Ibからなる。タンパク質の膜透過させる装置の分子機構の理解は進んでいない。その理由は「膜透過装置と基質タンパク質複合体を用いて、膜透過の動的な過程を原子分解能で捉える」ことが難しい事による。すでに研究を進めている二成分毒素複合体の系を用いて、膜透過の動的な複合体の構造をクライオ電子顕微鏡による単粒子解析で明らかにし、電気生理、膜透過したタンパク質の活性測定を通じて、タンパク質膜透過機構の詳細を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質の膜透過の機構の詳細はわかっていない。原核生物からヒトまでタンパク質をアンフォールドさせて透過する装置はいくつか存在するが、まだそのタンパク質透過機構の詳細は不明である。その理由は透過装置と基質タンパク質との複合体の構造の詳細がわかっていないことと、さらに次の透過の動的構造がわかっていないことによる。C. perfringens の二成分毒素であるイオタ毒素（ADPリボシル化毒素Iaとその細胞内への透過装置Ib)の構造解析を行なった(2020NSMB)。IaがIbへ結合してN末端が解けたIb膜孔の構造は、透過の最初の段階と考えられ、膜透過装置がシャペロンの働きを持つことを初めて示した。二成分毒素としてヒト感染症で最も注目を浴びているのはディフィシル菌由来のCDTである。ディフィシル菌はTcdA及びTcdBという、２つのRhoグリコシル化毒素を持ち、さらに第三の毒素である二成分毒素CDTの関与が疑われている。
R4年度、我々はC. perfringens の二成分毒素であるイオタ毒素の構造解析に続き、CDTa-CDTb膜孔のサンプル調整、構造解析を行い、さらに追加実験を行い、論文採択に至った（2022Nature Commun）。特に重要な点は、クライオ電子顕微鏡データの解析により、CDTaはCDTbに結合したばかりのインタクトな状態と、N末端が解けた状態の２つの状態、すなわち、タンパク質のアンフォールディングと共役した膜透過のための動的な構造変化を初めて捉えた。２つの二成分毒素の構造解析からA成分が膜透過装置に結合するだけでアンフォールディングする共通する機構がわかってきた。
R5年度、さらにこれらの研究を発展させ、最近日本で見い出されたに二成分毒素CPILE(別名BEC)の、構造と機能に着目し、特にB成分膜孔の狭窄部位に着目した実験を行ってきた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
二成分毒素としてヒト感染症で最も注目を浴びているのはディフィシル菌由来のCDTである。ディフィシル菌はTcdA及びTcdBという、２つのRhoグリコシル化毒素を持ち、さらに第三の毒素である二成分毒素CDTの関与が疑われている。我々はC. perfringens の二成分毒素であるイオタ毒素の構造解析に続き、CDTa-CDTb膜孔のサンプル調整、構造解析を行った。しかし最初の論文投稿で、多くの改訂をレビュワーから求められた。そのための再実験を含めた校正に時間を要した。特に表面プラズモン共鳴イメージングでのA成分とB成分の結合解析およびCDTbダブルヘプタマーの形成を探る点変異体の作成とゲル濾過による実験は新たに加えられた。さらにクライオ電子顕微鏡データの再解析により、タンパク質透過に関わる重要な情報が得られた：CDTaはCDTbに結合したばかりのインタクトな状態と、N末端が解けた状態の２つの状態：動的な構造が見えてきた。これは、この申請のテーマである動的な構造解析につながる結果となった。これらを合わせて論文を校正して、論文として採択された。
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| Strategy for Future Research Activity |
イオタ毒素Ibやディフィシル菌毒素CDTbでは最狭窄部位はPheでできたφクランプでできており、これがタンパク質膜透過に最も重要であることはわかっている. 一方、CPILE-bのクランプ最狭部位はSerでありセリンクランプと呼ばれる。セリンクランプとφクランプでは狭窄部位の大きさも疎水・親水といった違いもあり、どのような影響をしているのか興味深い。さまざまな方法によりセリンクランプとφクランプとの違いを比較検討している。すなわち、細胞毒性にどのような影響があるのか、CPILE-bのみ、それにCPILE-aを加えた時、これらのイオタ毒素との比較もしながら進めている。これに加えて、CPILEの構造解析と電気生理及び、腸管結紮ループ実験も含めて進める予定である。これらの実験から、φクランプのタンパク質膜透過に関わる重要な意味、またセリンクランプに置き換わった変異体での生理的意義について探っていく。
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