電位依存性イオンチャネルの機能構造と構造間遷移機構の解析による動作機構解明
| Project/Area Number |
21H02618
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
大澤 匡範 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 教授 (60361606)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横川 真梨子 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 講師 (60648020)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2022: ¥6,630,000 (Direct Cost: ¥5,100,000、Indirect Cost: ¥1,530,000)
Fiscal Year 2021: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000)
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| Keywords | 電位依存性イオンチャネル / 機能発現メカニズム / 構造生物学 / 機能構造 / 動作メカニズム |
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| Outline of Research at the Start |
電位依存性イオンチャネル(VGIC)は、神経伝達や心臓の拍動を担う膜タンパク質であり、創薬の標的としても重要である。VGICは一般に、膜電位に応じた構造変化によりイオン透過ゲートを開閉し、特定のイオンを膜透過させることで膜電位を制御する。しかしながら、これまではその構造遷移メカニズムは不明であった。
そこで本研究では、リガンドの結合や化学修飾により未解明である機能構造を安定化して構造解析を実現可能とする手法を確立し、その立体構造をX線結晶構造解析あるいは電子顕微鏡により原子レベルで明らかにするとともに、NMRによりそれらの間の構造遷移を解析することにより、VGICの動作メカニズムを解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
電位依存性イオンチャネル(VGIC)は、膜電位に応じた特定イオンの膜透過を通じて膜電位を制御し、神経伝達や心臓の拍動を担う膜タンパク質であり、創薬の標的としても重要である。VGICは一般に、膜電位依存的に静止構造・透過性構造・不透過性構造の間を遷移することによりゲートを開閉し、特定のイオンを膜透過させることで膜電位を制御する。しかしながら、これまでに複数の機能構造が原子分解能で明らかになったVGICはなく、膜電位のかかった静止構造や一過的にしか存在しない構造、および、機能構造間の遷移メカニズムは未解明である。
そこで本研究では、化学修飾により未解明である機能構造を安定化する手法を確立し、それぞれの構造の意味を電気生理学的解析により解明するとともに、それらの立体構造をX線結晶構造解析あるいはクライオ電子顕微鏡により原子レベルで明らかにする。同時にNMRによりそれらの間の構造遷移を解析することにより、VGICの動作メカニズムを解明することを目的とする。
本研究では、膜電位依存的に形成される電位依存性K+チャネルKvAPの各機能構造を安定化するために、電位センサードメイン内の2か所にCys変異を導入し両者をSS結合で固定化する。これまでに25種類のダブルCys変異体を調製し、SS結合形成能を評価したところ、5変異体において膜電位非存在下であってもSS結合が形成されることを見出した。これらの変異体に導入した2残基のCysは、すでに報告されているKvAPの電顕構造ではSS結合が形成できない距離にあるものが4個含まれていた。このことから、電位センサーの異なるコンホメーションがSS結合により安定化されたことが示唆された。
そこで、これらの5変異体がどのような機能状態を反映した構造であるか、電気生理学的に調べるとともに、試料の大量調製法を確立し、電顕での予備実験を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
電子顕微鏡でのチャネル粒子の観察から、当初の試料調製法ではチャネル機能を発揮するのに必要な4量体構造を形成していない可能性が示唆された。そこで、試料調製法を見直し、界面活性剤の変更やナノディスクへの再構成を試みたところ、野生型および複数の変異体で良好な電顕像が得られ、今後の方向性が明確になった。
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| Strategy for Future Research Activity |
各変異体について、クライオ電子顕微鏡での立体構造解析を進めるとともに、各変異体がどのような機能構造を反映したものか、電気生理学的な性状解析により明らかにしていく。
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Report
(2 results)
Research Products
(34 results)
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[Presentation] NMRを活用したSARS-CoV-2スパイクタンパク質とhACE2の相互作用を標的とするSARS-CoV-2侵入阻害化合物の分子設計2022
Author(s)
横川真梨子, 堀内まほろ, 金一駿希, 大竹帝河, 米澤朋起, 清水祐吾, 池田和由, 山本雄一朗, 酒井祥太, 野口耕司, 深澤征義, 大澤匡範
Organizer
日本薬学会 第143年会
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[Presentation] 新型コロナウイルスSARS-CoV-2スパイクタンパク質阻害剤の探索2022
Author(s)
小林明日香, 祝部真澄, 山本雄一朗, 村江真奈, 清水芳実, 酒井祥太, 深澤征義, 米澤朋起, 清水祐吾, 池田和由, 横川真梨子, 大澤匡範, 野口耕司
Organizer
第34回 微生物シンポジウム
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[Presentation] Gating-modifier toxin APETx1による電位依存性カリウムイオンチャネルhERG阻害機構の解析2021
Author(s)
松村 一輝, 下村 拓史, 久保 義弘, 岡 貴之, 小林 直宏, 今井 駿輔, 簗瀬 尚美, 秋元 まどか, 福田 昌弘, 横川 真梨子, 池田 和由, 栗田 順一, 西村 善文, 嶋田一夫, 大澤匡範
Organizer
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