高活性抗体の誘導を実現する抗原発現エキソソームの脾臓免疫技術基盤の構築

Research Project

Project/Area Number	21H02644
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Basic Section 47060:Clinical pharmacy-related
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	安藤英紀徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 准教授 (00735524)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	清水太郎大阪大学, 微生物病研究所, 特任講師(常勤) (30749388) 石田竜弘徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (50325271) 小出裕之静岡県立大学, 薬学部, 准教授 (60729177)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000) Fiscal Year 2023: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000) Fiscal Year 2022: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000) Fiscal Year 2021: ¥8,190,000 (Direct Cost: ¥6,300,000、Indirect Cost: ¥1,890,000)
Keywords	脾臓免疫 / 抗体誘導 / エキソソーム / リポソーム / 膜タンパク / ポリクローナル抗体 / 抗血清
Outline of Research at the Start	抗体医薬の開発において、抗原特異的な抗体を誘導する免疫技術は極めて重要であるが、従来の皮下免疫は立体構造が重要な膜タンパクに対する高活性な抗体を誘導するのが困難である。研究代表者らは以前に、リポソームを用いて抗原を脾臓に直接送達する新規免疫法（脾臓免疫）を考案しており、抗原特異的なIgG抗体を短期間で強く誘導できること、皮下免疫では得られないIgGサブクラスを得られることなどを実証している。本研究課題では、生体内で高い機能を発揮するエキソソームを用い、膜タンパクを発現させたエキソソームを脾臓免疫に応用することで、膜タンパクに対する高活性な抗体を世界で初めて誘導することを目指す。
Outline of Annual Research Achievements	B16マウスメラノーマ細胞を拡大培養し、超遠心法を用いて培養上清中のエキソソームを回収した。エキソソームの脾臓免疫として、空のPEG-Lipを静脈内投与した3日後にPEG修飾エキソソーム（PEG-Exo）を静脈内投与し、これを14日おきに2回繰り返した。エキソソームの皮下免疫として、エキソソーム懸濁液とフロイント完全/不完全アジュバントを混合したエマルジョンを皮下投与し、これを14日おきに2回繰り返した。最終投与11日後に血清を回収し、プロテインGカラムでポリクローナル抗体（pAb）を精製し、エキソソームに対する結合親和性をOctetシステムを用いて評価した。その結果、脾臓免疫pAbおよび皮下免疫pAbのいずれにおいても、エキソソームに対する結合性を示した。各免疫法で誘導されたpAbが認識するタンパク質を同定するため、Protein Gを結合させた磁気ビーズに各pAbを結合させ、B16由来エキソソームのタンパク抽出液を反応させた後、pAbが認識するタンパクの網羅的解析を行った。皮下免疫pAbあるいは脾臓免疫pAbがそれぞれ認識するタンパクに対してスキャッタープロットを作成した。検出された全1,626種類のタンパクの内、皮下免疫pAbで検出量が上昇したタンパクは全体の5.78%であったのに対し、脾臓免疫pAbで検出量が上昇したタンパクは8.24%であり、脾臓免疫でより多くのタンパクに対する抗体を誘導できることを示した。検出した標的タンパクの細胞内局在（細胞外領域、細胞膜、細胞質、核）で分類したところ、皮下免疫pAbあるいは脾臓免疫pAbのいずれにおいても、細胞内に局在する様々なタンパクに対する抗体の誘導が認められ、特に抗体誘導が難しいとされる細胞膜に局在するタンパクが比較的多く検出された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 令和4年度に計画していた「PEG修飾エキソソームを用いた脾臓免疫による抗体誘導評価」「誘導された抗体の特異性・結合親和性の評価」「エキソソームの脾臓免疫による抗体誘導メカニズムの評価」について、大きな変更点無く実施することができた。また、令和5年度に計画している「膜タンパクを発現させたエキソソームの脾臓免疫による抗体誘導評価」に向けた予備検討も行うことができ、令和5年度の研究計画についても、問題なく開始することが可能である。
Strategy for Future Research Activity	抗原を搭載したエキソソームの脾臓免疫による抗原特異的抗体の誘導を試みる。モデル抗原として緑色蛍光タンパク質（EGFP）を用い、プラスミドベクターを用いて細胞にEGFPを発現させた後にエキソソームを回収することで、EGFP封入エキソソームの調製を行う。搭載量が少ない場合は、エキソソームのマーカータンパクとの共発現ベクターを作成し、エキソソームへのEGFP搭載量の向上を試みる。調製したEGFP封入エキソソームの脾臓免疫あるいは皮下免疫を行い、回収した抗血清を用いて、EGFPへの結合性をウェスタンブロッティングあるいは分子間相互作用解析システムを用いて評価する。