Physiological significance and structure of TRP channel/ANO1 complex, and its clinical application

Research Project

Project/Area Number	21H02667
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Basic Section 48020:Physiology-related
Research Institution	National Institutes of Natural Sciences
Principal Investigator	富永真琴大学共同利用機関法人自然科学研究機構(機構直轄研究施設), 生命創成探究センター, 教授 (90260041)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥17,550,000 (Direct Cost: ¥13,500,000、Indirect Cost: ¥4,050,000) Fiscal Year 2023: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000) Fiscal Year 2022: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000) Fiscal Year 2021: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
Keywords	TRPチャネル / ANO1複合体 / カルシウム / ANO1 / 複合体
Outline of Research at the Start	TRPM2, TRPV3, TRPM8がCa2+活性化Cl-チャネルanoctamin1 (ANO1)と機能連関するかどうかを検討し、TRPチャネル/ANO1複合体およびCl-移動の生理学的意義の全容を明らかにする。次に、TRPチャネルとANO1複合体形成の構造基盤を明らかにする。ANO1と機能連関する複数のTRPチャネルのアミノ酸比較、キメラ体・点変異体解析によって、複合体形成に関わるモチーフやアミノ酸残基の同定を行う。TRPチャネル/ANO1複合体機能制御の臨床応用を見据え、複合体形成阻害剤やANO1阻害剤をスクリーニングして制汗薬や鎮痛薬の開発とヒトへの応用まで行う。
Outline of Annual Research Achievements	TRPチャネルは高いCa2+透過性を有しているが、その生理的意義は十分には明らかでない。興奮性細胞では陽イオンの流入による脱分極が電位作動性Na+チャネルを活性化して活動電位が起こるが、非興奮性細胞ではCa2+流入による様々なCa2+依存性の細胞応答が起こるとされている。これまで、TRPV4チャネルとCa2+活性化Cl-チャネルanoctamin1 (ANO1)が形質膜で複合体を形成し、機能連関によって水流出をもたらすこと、さらにTRPV1, TRPA1/ANO1複合体が感覚神経で脱分極の促進から痛み増強をもたらすことを報告してきた。2022年度は、TRPV3とANO1の機能連関を解析した。ヒトケラチノサイトでTRPV3とANO1の遺伝子発現を確認し、Ca2+-imaging法でTRPV3の刺激剤であるcamphorで細胞内Ca2+濃度の増大を観察した。パッチクランプ法で、TRPV3とANO1を共発現させた細胞でのみ、camphor刺激によるCl-電流の活性化を観察した。ヒトケラチノサイトを用いたwound healing assayでは、細胞の増殖・移動がANO阻害剤、TRPV3阻害剤、Cl-低溶液で抑制された。ヒトケラチノサイトの細胞内Cl-濃度は低く、ANO1活性化でCl-流入が起こっていると結論した。このCl-流入がMAPKの活性制御を介して細胞周期を調整してヒトケラチノサイトの増殖を起こしていることが明らかになった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason TRPV3とANO1の機能連関を明らかにすることができた（2023年論文発表）。これまでに、TRPV1, TRPV3, TRPV4, TRPA1というCa2+透過性の高いTRPチャネルとANO1の機能連関を証明してきた。これは、研究室の研究対象である温度感受性TRPチャネルがもつ高いCa2+透過性の生理的意義をある程度説明できるものと考えられる。感覚神経においてはCl-流出による脱分極の増強から痛みや痒みの増強、腺分泌細胞ではCl-流出をdriving forceとした水分泌（脳脊髄液、唾液、涙）の増大、表皮ケラチノサイトでは増殖・移動の促進による早い創傷治癒に関わっていることが明らかとなった。他にもCa2+透過性の高いTRPチャネルは多く、すでに明らかにしたTRPV1, TRPV3, TRPV4, TRPA1でも他の生理機能に関わっている可能性がある。
Strategy for Future Research Activity	TRPチャネルを介して流入したCa2+の作用として、Ca2+活性化K+チャネルがANO1と複合体を形成してCl-移動に伴って起こるK+移動を担っていると考えており、候補としてKCa3.1, KCa2.1, KCa1.1を考えている。HEK293細胞を用いた強制発現系と上皮細胞でパッチクランプ法を用いた電気生理学的解析と共免疫沈降法およびDuolink Assay含めた生化学的解析を行って、Ca2+活性化K+チャネルとTRPチャネルの物理的結合及び機能連関を明らかにする。この機能連関にはTRPM2も関わって３量体の複合体を形成するという予備的な結果を得ており、TRPM2の活性化で流入したCa2+がCa2+活性化K+チャネルを活性化することを電気生理学的（逆転電位のシフト）と薬理学的に証明する。そして、K+流出は水の流出を惹起することから、TRPM2活性化の下流でCa2+活性化K+チャネルの活性依存的な細胞容積変化が起こるかを検討する。Ca2+活性化K+チャネルの活性化はインフラマソームの活性化を惹起することが知られており、マウス脳内ミクログリアでサイトカイン産生が変化しているかどうかを検討する。Ca2+活性化K+チャネルの活性化は水流出を介して脳内ミクログリアの移動方向に対して尾部の分離収縮に寄与すると考えられることから、脳内ミクログリアの温度依存性の運動性へのCa2+活性化K+チャネルの関与を薬理学的に検討する。