ドライバー癌遺伝子誘導性の細胞老化を作用機序とする変異KRAS肺癌の創薬研究

• Project/Area Number: 21H02924
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 佐藤 光夫 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 教授 (70467281)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 芳川 豊史 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (00452334) ; 長谷 哲成 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (30621635) ; 湯川 博 名古屋大学, 未来社会創造機構, 特任教授 (30634646) ; 田中 一大 名古屋大学, 医学部附属病院, 助教 (40809810) ; 松井 佑介 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 准教授 (90761495)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥17,290,000 (Direct Cost: ¥13,300,000、Indirect Cost: ¥3,990,000); Fiscal Year 2023: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000); Fiscal Year 2022: ¥6,760,000 (Direct Cost: ¥5,200,000、Indirect Cost: ¥1,560,000); Fiscal Year 2021: ¥3,770,000 (Direct Cost: ¥2,900,000、Indirect Cost: ¥870,000)
• Keywords: 細胞老化 / 変異KRAS / 上皮間葉細胞転換 / 肺癌 / ドライバーがん遺伝子 / 創薬 / 肺がん

Outline of Research at the Start

変異KRAS癌の創薬を目的とする。代表者は自身開発の正常気管支上皮細胞モデルHBECにおいて、変異KRASの導入が細胞の悪性度を増強する一方で、細胞の増殖を停止させる癌遺伝子誘導細胞老化（oncogene-induced senescence; OIS）という現象に着目した。HBECモデルを用いたOIS回避機能に基づくプールshRNAライブラリースクリーニングを実施し、遺伝子Xを有望な治療標的候補として特定した。本課題では世界初のOIS誘導機序による肺癌治療薬の開発を目標とする。

Outline of Annual Research Achievements

本課題は変異KRAS癌の創薬を目的とする。代表者は自身開発の正常気管支上皮細胞モデルHBECにおいて、変異KRASの導入が細胞の悪性度を増強する一方で、細胞の増殖を停止させる癌遺伝子誘導細胞老化（oncogene-induced senescence; OIS）という現象に着目した。本年度は、本課題の目的達成の第一歩として、HBECモデルにおいて、変異KRASにより誘導されるOISの増殖抑制効果の詳細を検討した。我々はhTERT/Cdk4導入により不死化した正常気管支上皮細胞HBEC3に遺伝子操作を加えることによってtet-onシステムにより変異KRASG12V発現の精密な制御が可能となったHBEC3-RIN2を作成した。同細胞を用いて、変異KRASが正常気管支上皮細胞に与える影響を評価した。それらの結果の要点は2つである。①変異KRASは、HBEC3-RIN2において部分的な上皮系から間葉系への移行を引き起こし、これはZEB1およびSNAILの発現が関連した。②hTERT/Cdk4により不死化したHBEC3-RIN2細胞は、変異KRASによる老化誘導に対し高い抵抗性を持つことを示した。これらの知見に基づき、SNAIL増加がHBECにおけるOIS回避の原因であると仮説を立て、その制御がOIS誘導を機序とする治療開発に繋がると考えた。しかし、SNAILは核内の転写因子であるため薬理的な阻害は困難である。そこでSNAILの発現増加作用を持ち、膵癌において、OIS抑制作用が報告されたLysyl oxidase (LOX)に着目した。我々が実施した公共データベースを用いた肺癌の臨床検体の解析において、LOX高発現患者は予後不良でありLOXの癌促進的な機能を示唆した。以上から本年度は、LOXを標的とする肺癌のOIS誘導療法の開発を目指す。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

課題の開始当初はHBECモデルを用いたOIS回避機能に基づくプールshRNAライブラリースクリーニングを実施し、遺伝子Xを有望な治療標的候補として特定し、同遺伝子を標的とする化合物スクリーニングを実施した。しかし、薬効を評価する実験系の確立が困難であったため中止とした。一方で、hTERT/Cdk4により不死化したHBEC3-RIN2細胞は、変異KRASによる老化誘導に対し高い抵抗性を持つことを示し、その原因がSNAILを始めとする上皮間葉細胞転換誘導因子の増加に起因する可能性を示唆する結果を得た。そこで、本年度はLOXを標的とする肺癌のOIS誘導療法の開発を目指す

Strategy for Future Research Activity

LOXを標的とする肺癌のOIS誘導療法の開発を目指す。その目的のために以下を計画する。＜１．LOX遺伝子によるOIS抑制作用の評価＞変異KRASのオン・オフ発現が可能な不死化正常気管支上皮細胞（HBEC3-RIN2）および変異KRAS肺癌細胞株を用いて、LOXのノックダウンおよび過剰発現を行う。これによりLOX遺伝子によるOIS抑制作用の評価を行う。
＜２．LOXノックダウンの増殖抑制機序を解明＞LOXノックダウンがOIS以外の機序により増殖を抑制する可能性を検証する。そのために、上記１.の実験においてLOXノックダウン、過剰発現で変動した遺伝子を特定するためにRNA-seqを実施する。データの解析をエンリッチメント解析等にて実施する。さらにLOXの下流のマスターEMT遺伝子（SNAIL）ならびに、RNA-seqにより得られたLOXと関連の深い遺伝子についてウエスタンブロット、RT-qPCRを行い、LOXノックダウンの増殖抑制機序を明らかとする。
＜３．LOX遺伝子を標的とした創薬＞LOXの直接、もしくは、間接的な薬物阻害を探索する。有望なコンパウンドについては、HBEC3-RIN2と肺癌細胞において、それらの抗がん剤としての可能性を検証する。創薬企業に共同研究を提案し、創薬につなげることを目指す。

Research Products

• [Journal Article] High-performance glass filters for capturing and culturing circulating tumor cells and cancer-associated fibroblasts (2023)
  • Author(s): Tanaka Hiromasa、Iwata Daijiro、Shibata Yuki、Hase Tetsunari、Onoshima Daisuke、Yogo Naoyuki、Shibata Hirofumi、Sato Mitsuo、Ishikawa Kenji、Nagasawa Ikuo、Hasegawa Yoshinori、Ishii Makoto、Baba Yoshinobu、Hori Masaru
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 13 Issue: 1 Pages: 4130-4130
  • DOI: 10.1038/s41598-023-31265-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Resistance to mutant KRAS V12-induced senescence in an hTERT/Cdk4-immortalized normal human bronchial epithelial cell line (2022)
  • Author(s): Muraki N, Yamada M, Doki H, Nakai R, Komeda K, Goto D, Kawabe N, Matsuoka K, Matsushima M, Kawabe T, Tanaka I, Morise M, Shay JW, Minna JD, Sato M.
  • Journal Title: Exp Cell Res . Volume: 414 Issue: 1 Pages: 113053-113053
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2022.113053
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Leukocyte depletion and size-based enrichment of circulating tumor cells using a pressure-sensing microfiltration device. (2022)
  • Author(s): Onoshima D, *Hase T, Kihara N, Kuboyama D, Tanaka H, Ozawa N, Yukawa H, Sato M, Ishikawa K, Hasegawa Y, Ishii M, Hori M, Baba Y.
  • Journal Title: ACS Measurement Science Au Volume: 3 Issue: 2 Pages: 113-119
  • DOI: 10.1021/acsmeasuresciau.2c00057
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] An hTERT/Cdk4-immortalized normal human bronchial epithelial cell line is highly resistant to mutant KRAS-induced senescence (2022)
  • Author(s): Nao Muraki, Mitsuo Satoら
  • Organizer: 第25回アジア太平洋呼吸器学会（APSR）
  • Int'l Joint Research