ヒト未分化細胞から誘導した肺上皮細胞のメッシュ上培養を用いた感染症研究への展開

• Project/Area Number: 21H02925
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 伊藤 功朗 京都大学, 医学研究科, 准教授 (40447975)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今井 晶 (松島晶) 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (40828943) ; 今井 誠一郎 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (90572610) ; オケヨ ケネディオモンディ 京都大学, 医生物学研究所, 講師 (10634652)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000); Fiscal Year 2023: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2021: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
• Keywords: 肺胞上皮細胞 / 未分化細胞 / 培養 / 肺上皮細胞 / マイクロメッシュ / COVID-19 / 新型コロナウイルス / サイトカイン

Outline of Research at the Start

新型コロナウイルスは呼吸器の細胞に感染し、サイトカインストーム、肺傷害を引き起こすことで死亡するリスクが上る。患者によっては肺の炎症から肺の破壊が進行し、不可逆性となり呼吸不全が遷延する。肺胞上皮細胞を用いてウイルス感染症の病態研究はなされつつあるが、細胞の機能評価を行うためのシステムは開発途上である。本研究では、感染細胞の生理機能評価を行う系を工学分野との共同研究で開発する。

Outline of Annual Research Achievements

京都大学医学部附属病院呼吸器外科において施行された肺摘出組織から肺初代上皮細胞を用いて、感染症研究モデルとしての上皮シート開発を継続した。
第一に、マイクロメッシュに細胞外マトリクスの薄膜を張った培養基材について、薄膜をPFA固定したものを低濃度の細胞外マトリクスでコートすることで良好な接着が得られており、細胞間接着分子である上皮型カドヘリン、オクルディン、および肺胞上皮マーカーの発現について、固定標本の免疫蛍光染色と定量的RT-PCRで確認した。
本研究におけるマイクロメッシュと細胞外マトリクスの薄膜を組み合わせた培養基材において、薄膜の厚さを測定したところ、約１～3μmであった。これは、生体内における厚さ数十～数百nmの基底膜より厚いものの、市販の樹脂や生体高分子を用いた培養基材（厚さ数百μm）より格段に薄く、肺胞上皮細胞と血管内皮細胞が基底膜を介して近接し、ガスや物質の交換を行うモデルの構築を可能にするものと考えられた。これを踏まえ、薄膜の片面に肺胞上皮を、他の面にはヒト肺の毛細血管由来の血管内皮細胞を播種し、肺胞の機能単位を再現したモデルの開発に着手した。血管内皮細胞はメッシュ上でCD31を発現する単層シートを形成した。当初はメッシュ上への定着を維持することが課題であったが、薄膜をコートする細胞外マトリクスの種類と濃度を調整することにより、１週間程度の維持が可能となった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

肺胞上皮細胞と血管内皮細胞とで培養基材の両面にシートを形成させる過程において、それぞれの細胞を播種する時期と密度を調整が必要である。また、こうして作成したモデルについて、分化マーカーの発現や経上皮電気抵抗の測定などによる品質の評価を行うことが今後の課題である。品質評価の結果を踏まえて、作成したモデルのロット間のばらつきを最小化するために厳密なプロトコルを確定する必要がある。

Strategy for Future Research Activity

シートの上下面での二層培養を確立する。上皮シートの特性評価の一環として、免疫染色及びqRT-PCRによりⅠ型、Ⅱ型肺胞上皮のマーカーの発現を経時的に確認する。また、上皮細胞への侵襲（ウイルス感染など）を非破壊的かつ持続的にモニターするための器材を作成する。