| Project/Area Number |
21H02983
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 55010:General surgery and pediatric surgery-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
尾崎 倫孝 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (80256510)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小澤 岳昌 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (40302806)
森田 直樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 総括研究主幹 (60371085)
芳賀 早苗 北海道大学, 保健科学研究院, 特任講師 (60706505)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2021: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
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| Keywords | 光治療 / ランタニド・ナノ粒子 / 再生医療 / 増殖能 / 生存能 / 光操作 / 近赤外光 / アップ・コンバージョン / 再生 / 修復 / 創傷治癒 / 光プローブ |
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| Outline of Research at the Start |
外科領域において、創傷治癒の遅延、吻合部の縫合不全は術後合併症につながる。糖尿病、腎不全などの基礎疾患を有している場合には、このような合併症が起こりやすく予後にも影響する。
本研究は、そういった状況に対応するために、侵襲の少ない光を利用した生体内病変の分子・細胞機能操作技術の開発を試みる。体表から深部にいたる傷害組織を光照射により、分子レベル・細胞レベルで修復・再生する技術は多くの先端的技術開発を必要とするが、臨床的に術後消化管などの縫合不全の予防・治療、創傷治癒促進、褥瘡・深部臓器の挫傷の治癒促進、移植臓器機能の改善、虚血性疾患の治療、など広い分野への応用が期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
外科領域において、創傷治癒の遅延、吻合部の縫合不全は術後予後に重大な影響を与える。そのような状況に対応することを目的として、今回光を利用した生体内病変の分子・細胞機能操作技術の開発を試みる。光照射による生体内分子の操作に必要な技術開発を行うが、術後消化管などの縫合不全の予防・治療、創傷治癒促進、褥瘡・深部臓器の挫傷の治癒促進、移植臓器機能の改善、虚血性疾患の治療など広い分野への応用が期待される。
当該年度に実施した研究の成果
【近赤外光照射装置の準備およびランタノイド・ナノ粒子（LNP）の調整】細胞に近赤外光を照射するための近赤外光照射装置をデザインし作製した。LNPは生体内送達を可能にするため、血管内で塞栓を起こさず貪食細胞による貪食可能なサイズとした。近赤外光照射によりLNPから青色光を発することを確認した後、二種類の光を利用した照射システムを構築した。
【培養細胞における青色光による遺伝子発現システムの開発】青色光照射による遺伝子発現誘導システムを開発する目的で、ルシフェラーゼ発現誘導系を構築し、生体組織内でも十分に機能するの発現量と発現持続性を得る条件を検討した。まず、細胞レベルにて、本遺伝子発現システムに導入するターゲット分子として、主要な細胞生存シグナル分子であるAkt分子を選び、その機能評価を行った。その後、Akt分子を青色光で制御するためのプローブをデザイン・作製した（Photo-activatable Akt probe; PA-Akt）。PA-Aktプローブのデザインと作製には、split luciferaseを応用した技術を用いた。PA-Aktプローブ遺伝子を細胞内に導入し、青色光照射による生存能・増殖能の制御評価を行った。PA-Aktプローブ遺伝子の導入し青色光を照射した細胞では、期待通り低酸素、低栄養などのストレスに対する耐性を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
【近赤外光照射装置の準備およびランタノイド・ナノ粒子（LNP）の調整】および【培養細胞における青色光による遺伝子発現システムの開発】については、当初計画に基づいて研究を進めた。
しかしながら、コロナ感染症の拡大・蔓延による材料不足あるいは入手に時間がかかったことにより、光照射装置およびランタニド・ナノ粒子（LNP）の調整や照射システムの構築に想定以上の時間を要する結果となった。その後の実験は、当初の計画に沿って検討を進めることが出来たが、当初予定していた【LNPを介した光操作のための基礎的条件検討】については後れを生じた。
また、光照射により遺伝子を発現させるにあたり、臨床で求められる十分な遺伝子発現量を得ること、あるいはそのための至適条件を決定することが、予想外に困難であることが判明した。また、光照射により若干の発熱反応が惹起されることも観察され、実際に使用する際は連続的な光照射は困難であり、時間間隔をあけ不連続的な照射条件が適切であると考えられた。今後（次年度以降）、光による遺伝子の発現条件を追加検討し、生体内にて十分に遺伝子発揮する光照射条件を設定することが必要となった。
この理由から本研究課題の進捗状況は、「やや遅れている」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、予定通り次の実験を遂行する。
【LNPを介した光操作のための基礎的条件検討】および【臨床で求められる十分な遺伝子発現を得るための至適条件の検討】細胞レベルの実験により、光照射により臨床で求められる十分な遺伝子発現を得るための至適条件を決定する。光照射の強度、照射時間、照射間隔、LNP量・細胞量バランスなどを検討する。
【光照射による発熱の程度と細胞への影響の検討】様々な細胞に対して、近赤外光を様々な条件で照射して実験する（光照射の強度、照射時間、照射間隔など）。それによる細胞傷害の有無、増殖能への影響を検討し、光プローブが供与する生存・再生・増殖効果と温度上昇が与える細胞への傷害効果を併せて検討し、再生に向けてネガティブを抑えかつ最大限の効果を得られる至適条件を設定する。
【最適と考えられる条件による細胞への光照射と細胞への効果・影響の総合的な検討】上記の実験で得られた成果をもとに、各種細胞に対する効果を検討する。PA-Aktプローブを遺伝子導入した細胞（実質細胞、非実質細胞[線維芽細胞など]）を作製し、低酸素・低温・高温ストレスといった条件の下で、近赤外光あるいは青色光を照射し、細胞の耐性能、細胞増殖能、細胞生存能の向上に対する効果を検証し、臨床応用への可能性を最終的に検討する。
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