Understanding of the musculoskeletal system regulated by the transcription factor Scleraxis
| Project/Area Number |
21H03107
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 57010:Oral biological science-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
宿南 知佐 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (60303905)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
隅山 健太 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (00370114)
樋口 真之輔 神戸大学, 附属学校部, 附属中等教育学校教諭 (20847131)
吉本 由紀 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 講師 (40735304)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥17,420,000 (Direct Cost: ¥13,400,000、Indirect Cost: ¥4,020,000)
Fiscal Year 2023: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,850,000 (Direct Cost: ¥4,500,000、Indirect Cost: ¥1,350,000)
Fiscal Year 2021: ¥7,410,000 (Direct Cost: ¥5,700,000、Indirect Cost: ¥1,710,000)
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| Keywords | 腱・靱帯 / Scleraxis / エンハンサー / 遺伝子改変動物 / enChIP / Sox9 / enChIP法 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、Transgenicマウス胚と培養細胞を用いたレポーターアッセイ、ゲノム編集技術を応用したengineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation(enChIP)法、独自に作成した遺伝子改変マウスを用いた細胞系譜と表現型の解析、免疫染色と次世代シーケンスを組み合わせた新たなOmics技術であるChromatin Integration Labeling sequencing(ChIL Seq)法などを組み合わせて、分子レベルでScxを基軸とする生命現象を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Scx遺伝子の下流に同定した1.97 kbのenhancer領域を、さらに分割し、ゲノム領域をhsp68のminimal promoterとTol2配列を有するLacZ reporterベクターに組み込んたベクターを受精卵にmicroinjectionし、得られたTgマウス胚のLacZ活性をX-gal染色によって解析した。その結果、343 bpのゲノム断片にenhancer活性が検出され、哺乳類、鳥類、シーラカンスまで高度に保存されているモチーフが存在することを見出した。このゲノム領域をpGL4.23に組み込み、enhancer領域に結合する候補となる転写因子の発現ベクターと共に、HEK293T細胞、ATDC5細胞、腱細胞に導入し、Dual luciferase assayを行った。また、昨年度に引き続き、enChIPによる解析も進めている。系譜解析では、ScxCre/+:RosaTomatoマウスを用いた解析によって、２週齢の脛骨では、Scxの発現履歴がある細胞は、付着している腱や靱帯に限局しているが、６週齢になると、皮質骨や一次海綿骨の一部の骨芽細胞でも観察されることを見出している。免疫染色を行うと、それらの細胞では、Runx2の発現が検出された。ScxCreERT2;RosaTomatoマウスに、肋骨でのScxの発現が検出される胎生11.5日より後に4-ヒドロキシタモキシフェンを投与して、Tomatoの発現を観察したところ、肋骨でのCreの発現を回避することが出来ることが確認出来た。Sox9CreERT2;RosaTomatoマウスでの解析では、生後、Sox9の発現する細胞が骨格筋でも検出された。Sox9発現領域でScxを欠失するSox9Cre;Scxflox/floxマウスと野生型マウスの顎関節、腱の付着部、頭蓋の縫合部の形態・組織学的変化を解析している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Scxの腱・靱帯特異的転写制御領域の絞り込みは、Tgマウス胚を用いた解析で順調に進んでいる。絞り込んだ領域に、種間で高度に保存されているモチーフも見出されており、Scxの発現を誘導・維持する機構についての手がかりが得られている。腱・靱帯以外でのScxの発現についても、他のマーカー遺伝子の発現を調べることによって、細胞の特性が明らかになりつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに同定しているScxの腱・靱帯特異的転写制御領域内で見出されているモチーフの役割について、更に解析を進める。Scxの骨における機能的な役割を明らかにするとともに、Sox9発現領域でScxを欠失するコンディショナルノックアウトマウスの表現型をScx欠失マウスの表現型とも比較しながら解析する。
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Report
(2 results)
Research Products
(16 results)
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[Journal Article] Scleraxis upregulated by transforming growth factor-β1 signaling inhibits tension-induced osteoblast differentiation of priodontal ligament cells via ephrin A22021
Author(s)
Kawatsu M, Takeshita N, Takimoto A, Yoshimoto Y, Seiryu M, Ito A, Kimura S, Kawamoto T, Hiraki Y, Shukunami C, Takano-Yamamoto T
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Journal Title
Bone
Volume: 149
Pages: 115969-115977
DOI
Related Report
Peer Reviewed
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[Presentation] 腱・靭帯分化誘導システムにおけるシングルセル解析2022
Author(s)
吉本由紀, 上住聡芳, 上住円, 田中かおり, YU Xinyi, 黒澤珠希, 山家新勢, 前原一満, 大川恭行, 外丸祐介, 宿南知佐
Organizer
第45回日本分子生物学会年会
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Invited
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