| Project/Area Number |
21H04707
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村田 道雄 大阪大学, 蛋白質研究所, 特任教授 (40183652)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
花島 慎弥 鳥取大学, 工学研究科, 教授 (50373353)
土川 博史 大分大学, 医学部, 特任講師 (30460992)
梅川 雄一 大阪大学, 大学院理学研究科, 助教 (20587779)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥38,350,000 (Direct Cost: ¥29,500,000、Indirect Cost: ¥8,850,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2023: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000)
Fiscal Year 2022: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000)
Fiscal Year 2021: ¥16,250,000 (Direct Cost: ¥12,500,000、Indirect Cost: ¥3,750,000)
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| Keywords | 脂質ラフト / 生体モデル膜 / 糖脂質 / 非対称脂質二重膜 / 脂肪鎖の指組構造 / 同位体標識脂質 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、生体膜の機能を再現できる新しい脂質二重膜のモデルを創出する。そのためには、二重膜の外側と内側、およびそれらの界面の脂質分子の相互作用を解明し、その共通性・法則性を知ることが最も重要である。しかし、生体膜は脂質以外の多様な成分を含む非常に複雑な分子集合体であるので、共通性・法則性を調べるには適していない。そこで本研究では、脂質の形と動きを調べるために標識を付けた膜脂質を化学合成し、それらを組み込むことによって、生体膜の特徴を再現できる新しいモデル脂質膜を作り出す。それらを各種の分析法に供することによって、生体膜特有の機能を司る分子構造および相互作用を解明して生体膜の理解を深める。
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、引き続き生体膜の機能のなかで、脂質ラフト（Lo/Ld相分離状態）と内・外葉の非対称性を備えた脂質二重膜のモデルを創出することに注力した。特に、Lo/Ld相分離状態についての興味深い実験結果が得られたので以下に述べる。
まず、スフィンゴミエリン(SM)が形成する脂質ラフト(Lo)相に膜貫通タンパク質p24が分配する機構を、貫通部位のペプチドを用いて精査した。p24ペプチドがLo相へ分配された時にペプチドとの接触確率の高い脂質を、31P NMRシグナルの横緩和時間（T2）を測定することによって判別した。その結果、SM(Lo脂質)とペプチドの接触は、DOPC(Ld脂質)に比べて低頻度であることがわかり、SMがナノサブドメインを形成し、そのDOPCを含む間質部分にペプチドが存在するという我々のモデルの妥当性は支持された。
次に、ナノサブドメインにおけるDPPC(ジパルミトイルフォスファチジルコリン)分子の配向状態をDPPCの2つの脂肪鎖それぞれについて調べた。このために、2H/13C-二重標識脂肪酸を化学合成して、DPPCのsn-1とsn-2の各々に導入した。固体NMRから得られる四極子分裂と磁気双極子相互作用によって、２つのベクトルの膜法線に対する配向を求めた。その結果、従来の予想に反して２つのアシル鎖が法線からほぼ同じ角度で僅かに傾いている事が明らかとなった。同様の結果は、SMについても得られた。これは、DPPCとSMは同様にナノサブドメインを形成し、それらの性状はゲル相における脂質鎖充填構造を部分的に模していることを示唆している。これらの成果は、生体脂質の相互作用に重要なLo/Ld相分離状態における分子構造的描像の取得を可能にし、生体膜の物性発現機構の理解につながる成果であると考える。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、脂質の形と動きを調べるために安定同位体で標識を付した膜脂質プローブを効率的に化学合成し、それらを組み込むことによって、生体膜の特徴を一部再現することができた。また、標識の必要のない31P NMRを有効に利用することによって、汎用性の高い固体NMR手法を開発できたことは特筆に値すると考える。
さらに、存在量の多いリン脂質以外の脂質として糖脂質の生体膜物性に与える効果を調べることができた。これらの希少脂質は細胞膜に均等に存在するのではく、局所的に集合して膜物性に影響を与える濃度に達していると考えられる。したがって、本研究が端緒となって、糖脂質の生体膜構成脂質としての機能の解明が進むものと期待している。以上により、本研究の第２年度目を終了した時点で、当初の目的に照らして十分な進捗が得られたと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度の研究方針として、非対称二重膜を用いた膜脂質のドメイン形成を含めて生体膜の脂質局在を忠実に再現できる新しいモデル膜の創出を目指す。具体的には、以下の３つのテーマを推進することで、この目標を達成したい。
a) 内葉脂質および外葉脂質の水和層におけるヘッドグループの配向とコンフォメーションの解析：非対称膜において、内葉に局在化する脂質ホスファチジルイノシトール（PI）やその二リン酸化体のドメイン形成能を調べる。また、スフィンゴミエリンによるナノサブドメインとこれら脂質との葉間相互作用の有無を明らかにする。
b) 内葉と外葉の疎水層の構造相関による葉間脂質相互作用のメカニズムの解明： 非対称膜を用いたインターディジテーション（指組み構造）の観察、相状態への影響を評価する。非対称膜における外葉と内葉のコレステロール分布比を決定し、そのドメイン構造に与える影響を精査する。
c) ドメイン形成における生体内微量脂質の役割の解明： 引き続きコレステリルグルコシドを含むステロール配糖体や、特定の環境条件下で増加する膜脂質のドメイン形成効果を調べることで、これらの微量膜脂質の生物学的機能を推察する。
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