Epigenomics of meiotic chromosomes driven by cell-cell transport of small RNAs in Poaceae species

• Project/Area Number: 21H04729
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 39:Agricultural and environmental biology and related fields
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 野々村 賢一 国立遺伝学研究所, 遺伝形質研究系, 准教授 (10291890)
• Project Period (FY): 2021-04-05 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥41,600,000 (Direct Cost: ¥32,000,000、Indirect Cost: ¥9,600,000); Fiscal Year 2025: ¥8,320,000 (Direct Cost: ¥6,400,000、Indirect Cost: ¥1,920,000); Fiscal Year 2024: ¥7,930,000 (Direct Cost: ¥6,100,000、Indirect Cost: ¥1,830,000); Fiscal Year 2023: ¥8,450,000 (Direct Cost: ¥6,500,000、Indirect Cost: ¥1,950,000); Fiscal Year 2022: ¥8,060,000 (Direct Cost: ¥6,200,000、Indirect Cost: ¥1,860,000); Fiscal Year 2021: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
• Keywords: 減数分裂 / 植物 / 生殖 / エピゲノム / 細胞壁リプログラミング / イネ / 小分子RNA / エピジェネティクス / 細胞壁 / カロース / 葯

Outline of Research at the Start

生殖細胞は、ゲノム撹乱要因であるトランスポゾンの不活化によりゲノム恒常性を維持する一方、新たな遺伝子組み合わせを創出して次世代に伝達する。この過程で重要な役割を担う減数分裂では、クロマチン修飾がリモデリングされ、それが減数分裂組換え頻度や位置の決定に寄与する。同機構に関連する遺伝子の改変は、優良形質と一緒に劣悪形質遺伝子が導入される「連鎖の引きずり」の解消など、育種効率向上につながる。本課題では、イネの葯における減数分裂染色体のエピゲノム制御に着目し、減数分裂特異的に発現する小分子RNAが体細胞から隣接する生殖細胞に移行し、細胞非自律的にエピゲノム制御に加わる可能性の検証を目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

イネの葯で減数分裂特異的に発現する小分子RNAを中心とした細胞間シグナル因子による、細胞非自律的な減数分裂染色体のエピゲノム制御機構の解析を目的とする。
イネ減数分裂期の生殖細胞核への高度な蓄積が確認されたAGO4aタンパク質の機能欠損変異体（ago4a変異体）を作成し、機械的に単離した減数分裂期の雄性生殖細胞を用いたゲノムワイドバイサルファイトシーケンス（GWBS）により、減数分裂進行に伴うDNAメチル化の変化を正常体とago4a変異体で比較した。その結果、(1) 減数分裂特異的小分子RNAとして知られる24塩基長phasiRNAの前駆体ゲノム領域（24PHAS領域）が減数分裂初期から終期（四分子期）にかけてDNAメチル化が上昇すること、(2) (1)で検出された24PHAS領域のDNAメチル化は部分的にAGO4aに依存することなどを見出した。昨年度にAGO4aが24塩基長phasiRNAと結合する結果を得ており、今回の結果と一致した。
しかし、24塩基長phasiRNA分子種の多さを考慮するとAGO4a/phasiRNA依存的にメチル化を受ける24PHAS領域の数は期待を遥かに下回っていた。そこで、AGO4aのパラログであるAGO4bとの二重変異体の作成に着手した。
昨年度、活性酸素（ROS）生成酵素RBOHの変異体解析から、減数分裂直前の葯におけるROS濃度の上昇が、正常な減数分裂開始・進行に重要な役割を果たす可能性を見出した。今年度は、rboh変異体における減数分裂異常を再確認するとともに、RBOH遺伝子/タンパク質の発現時期・部位を特定する目的でRBOH-GFPを発現する形質転換イネの作成に着手した。
また、葯における小分子RNA小胞輸送のイメージングのため、小分子RNAレポーターおよび細胞外小胞膜特異的タンパク質レポーターを発現する形質転換イネの作成に着手した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今年度に実施したGWBSは、機械的に単離した減数分裂期の雄性生殖細胞を対象としている。減数分裂特異的な24塩基長phasiRNAの多くは、雄性生殖細胞と接するタペート細胞（体細胞）で生産されることが代表者の過去の研究から明らかとなっているが、GWBSの結果から、24塩基長phasiRNAおよびAGO4aタンパク質は、減数分裂中の生殖細胞におけるゲノムDNAのメチル化に寄与する可能性が示された点は、本課題の当初の予想と合致するもので、新規性が極めて高い成果が得られたと自負する。
ただ、イネゲノム中に100ヶ所以上存在する24PHAS領域の一部でしかAGO4依存的なDNAメチル化の上昇が検出できなかった点は期待を下回るものであった。しかし、その結果も見越した上でAGO4aパラログの変異体も作成しており、二重変異体を2023年度中に確立できたことから、当初計画の遂行から若干遅れるものの、全体的には概ね順調に推移していると考えている。
一方、カロース合成酵素GSL5の変異体解析を実施し、減数分裂直前における生殖細胞の細胞壁リプログラミングが減数分裂進行に与える影響を明らかにすることに成功し、著名な植物専門誌に成果を発表した。また、減数分裂直前の葯におけるGSL5発現の上流因子としてROS生成酵素RBOHが機能している可能性を、rboh変異体の解析から見出すことができた。既にRBOH-GFP発現イネの作成にも着手しており、小分子RNAレポーターおよび細胞外小胞レポーター発現イネの作成と合わせて、計画は極めて順調に推移している。
上記から、本課題は予定通り順調に推移していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今年度作成したAGO4二重変異体では、それぞれの一重変異体ではみられない表現型が観察されたため、本課題で当初予想していた減数分裂期における変異表現型も一重変異体より顕著になる可能性が十分期待できる。そこで、二重変異体を用いて減数分裂染色体の挙動解析、および単離した雄性生殖細胞を用いたGWBSおよびトランスクリプトーム解析などを実施する予定である。
また、24塩基長phasiRNAの生合成に関わる遺伝子の変異体作成も進めており、一部の変異体では葯における24塩基長phasiRNAの蓄積量が減衰していることも確かめている。これらの変異体も上記と同様の解析を行うことを予定している。
ROS生成酵素RBOHについては、減数分裂直前の葯における機能解析は未だ報告がない。RBOH遺伝子/タンパク質の発現時期・部位の詳細な解析やトランスクリプトーム解析などによる下流遺伝子の探索、生殖細胞壁リプログラミングにおける機能、減数分裂への影響などを詳細に解析し、成果を論文発表する予定である。小分子RNAレポーターおよび細胞外小胞レポーター発現イネの作出に成功した場合、rboh変異体と組み合わせて、RBOH依存的な生殖細胞壁リプログラミングが、細胞外小胞依存的な小分子RNA、特に減数分裂特異的24塩基長phasiRNAの細胞間コミュニケーションに与える影響を調査する予定である。
上記の成果を合わせることでAGO4、減数分裂特異的24塩基長phasiRNA、そして生殖細胞壁リプログラミングが、減数分裂の開始・進行に果たす役割の解明を目指す。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Hamburg University(ドイツ)
• [Int'l Joint Research] Hamburg University(ドイツ)
• [Journal Article] Heat shock-inducible clonal analysis reveals the stepwise establishment of cell fate in the rice stem (2023)
  • Author(s): Tsuda Katsutoshi、Maeno Akiteru、Nonomura Ken-Ichi
  • Journal Title: The Plant Cell Volume: 35 Issue: 12 Pages: 4366-4382
  • DOI: 10.1093/plcell/koad241
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genetic Regulation of Mitosis - Meiosis Fate Decision in Plants: Is Callose an Oversighted Polysaccharide in These Processes? (2023)
  • Author(s): Somashekar Harsha、Nonomura Ken-Ichi
  • Journal Title: Plants Volume: 12 Issue: 10 Pages: 1936-1936
  • DOI: 10.3390/plants12101936
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comparison of constitutive promoter activities and development of maize <i>ubiquitin</i> promoter- and Gateway-based binary vectors for rice (2022)
  • Author(s): Katsutoshi Tsuda, Toshiya Suzuki, Manaki Mimura and Ken-Ichi Nonomura
  • Journal Title: Plant Biotechnology Volume: 39 Issue: 2 Pages: 139-146
  • DOI: 10.5511/plantbiotechnology.22.0120a
  • ISSN: 1342-4580, 1347-6114
  • Year and Date: 2022-06-25
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Rice GLUCAN SYNTHASE-LIKE5 promotes anther callose deposition to maintain meiosis initiation and progression (2022)
  • Author(s): Somashekar Harsha、Mimura Manaki、Tsuda Katsutoshi、Nonomura Ken-Ichi
  • Journal Title: Plant Physiology Volume: 191 Issue: 1 Pages: 400-413
  • DOI: 10.1093/plphys/kiac488
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] RNA-Binding Protein MAC5A Is Required for Gibberellin-Regulated Stamen Development (2022)
  • Author(s): Liu Hua、Shang Hongna、Yang Huan、Liu Wenjie、Tsugama Daisuke、Nonomura Ken-Ichi、Zhou Aimin、Wu Wenwu、Takano Tetsuo、Liu Shenkui
  • Journal Title: International Journal of Molecular Sciences Volume: 23 Issue: 4 Pages: 2009-2009
  • DOI: 10.3390/ijms23042009
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Presentation] CHH hypermethylation at 24PHAS loci during meiosis in rice male meiocytes (2023)
  • Author(s): Huong Ta, Taiji Kawakatsu, Atsushi Toyoda, Mutsuko Nakano, Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: 第65回日本植物生理学会年会
• [Presentation] CALLOSE, AN UNSUNG POLYSACCHARIDE FOR MALE MEIOSIS INITIATION AND PROGRESSION IN RICE (ORYZA SATIVA. L) (2023)
  • Author(s): Harsha Somashekar, Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: 20th International Symposium on Rice Functional Genomics
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] イネ減数分裂周期の制御における生殖母細胞壁リモデリングの役割 (2023)
  • Author(s): 野々村 賢一
  • Organizer: 細胞壁研究者ネットワーク第17回定例研究会
• [Presentation] Anther callose deposition maintains proper meiosis initiation and progression plausibly via cell-cell signalling in rice anthers (2023)
  • Author(s): Harsha Somashekar, Manaki Mimura, Keiko Takanami, Katsutoshi Tsuda, Rie Hiratsuka, Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: EMBO Workshop Meiosis 2023
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Missing link in plant meiosis initiation - The role of post-transcriptional regulation and callose, the cell wall polysaccharide (2023)
  • Author(s): Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: Plant Science for Beautiful World -Real Dynamics of Plant Chromosomes
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular dynamics of rice MEL2 as a component of cytoplasmic RNP granules regulating proper meiosis initiation (2023)
  • Author(s): Manaki Mimura, Seijiro Ono, Harsha Somashekar, Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: The 33rd international Conference on Arabidopsis Research
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Effect of callose on symplast and apoplast related events in controlling proper meiosis initiation in rice anther locules (2023)
  • Author(s): Harsha Somashekar, Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: The 33rd International Conference on Arabidopsis Research
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Rboh-mediated ROS production plays an important role in initiation and progression of male meiosis in rice (Oryza sativa. L) (2023)
  • Author(s): Harsha Somashekar, Hidetaka Kaya, Shigeru Hanamata, Takamitsu Kurusu, Kazuyuki Kuchitsu, Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: 第64回日本植物生理学会年会
• [Presentation] 植物の減数分裂移行を促進する分子機構の解明に向けて (2022)
  • Author(s): Harsha Somashekar, 三村真生, 津田勝利, 野々村賢一
  • Organizer: 日本遺伝学会第94回大会
  • Invited
• [Presentation] Dynamics of cytoplasmic connections mitosis-meiosis transition in rice (2022)
  • Author(s): Harsha Somashekar, Keiko Takanami, Rie Hiratsuka, Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: 日本植物学会第86回大会
• [Presentation] 減数分裂移行に重要なイネMEL2について各種ドメインを欠損した変異タンパク質の生殖細胞内局在 (2022)
  • Author(s): 三村真生, Somashekar Harsha, 野々村賢一
  • Organizer: 日本植物学会第86回大会
• [Presentation] Understanding the importance of cell-cell communication for plant meiosis using rice (Oryza sativa) as model organism (2021)
  • Author(s): Harsha Somashekar, Manaki Mimura, Tsuda Katsutoshi, Ken-Ichi Nonomura
  • Organizer: EMBO Workshop: Intercellular communication and plasmodesmata in plant development and disease (virtual)
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 正常な雄性減数分裂進行に必要なイネ葯室細胞間隙へのカロース多糖の高蓄積 (2021)
  • Author(s): ソマシェカーハーシャ, 三村真生, 津田勝利, 野々村賢一
  • Organizer: 日本遺伝学会第93回大会
• [Presentation] イネ葯室へのカロース高蓄積は減数分裂開始時期の制御に必須である (2021)
  • Author(s): ソマシェカーハーシャ, 三村真生, 津田勝利, 野々村賢一
  • Organizer: 日本育種学会 第140回講演会
• [Book] 遺伝学の百科事典（分担執筆範囲：花粉と胚のうの形成, p.304-305） (2022)
  • Author(s): 日本遺伝学会
  • Total Pages: 690
  • Publisher: 丸善出版
  • ISBN: 9784621306604
• [Remarks] 茎の節間は最後に生まれてくる－茎の発生学への挑戦－
  • URL: https://www.nig.ac.jp/nig/ja/2023/09/research-highlights_ja/pr20230928.html
• [Remarks] 植物の減数分裂運命決定機構に関する総説を発表
  • URL: https://www.nig.ac.jp/nig/ja/2023/05/research-highlights_ja/rh20230509.html
• [Remarks] 植物生殖研究における長年の謎を解明！ &#12316; カロースによる減数分裂の開始制御 ～
  • URL: https://www.nig.ac.jp/nig/ja/2022/10/research-highlights_ja/pr20221023.html
• [Remarks] 独立行政法人日本学術振興会 科研費 研究成果トピックス
  • URL: https://topics.jsps.go.jp/Opac/LpSxvk1jrG98S_8z0LP756gxi5e/VJ2f6EZlKjSoLWShd3zVU4Sqfxo/description.html
• [Remarks] 植物細胞遺伝研究室ホームページ
  • URL: http://nonomuralab-nig.sakura.ne.jp/NonoLab_HP/top_j.html