| Project/Area Number |
21H04730
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 40:Forestry and forest products science, applied aquatic science, and related fields
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
浦木 康光 北海道大学, 農学研究院, 教授 (90193961)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
重冨 顕吾 北海道大学, 農学研究院, 講師 (20547202)
鈴木 栞 北海道大学, 農学研究院, 助教 (20867155)
堤 祐司 九州大学, 農学研究院, 教授 (30236921)
玉井 裕 北海道大学, 農学研究院, 教授 (50281796)
綿岡 勲 京都工芸繊維大学, 繊維学系, 准教授 (70314276)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥42,900,000 (Direct Cost: ¥33,000,000、Indirect Cost: ¥9,900,000)
Fiscal Year 2025: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2024: ¥5,070,000 (Direct Cost: ¥3,900,000、Indirect Cost: ¥1,170,000)
Fiscal Year 2023: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000)
Fiscal Year 2022: ¥5,460,000 (Direct Cost: ¥4,200,000、Indirect Cost: ¥1,260,000)
Fiscal Year 2021: ¥22,230,000 (Direct Cost: ¥17,100,000、Indirect Cost: ¥5,130,000)
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| Keywords | リグニン / 人工多糖類マトリックス / 成長反応 / QCM-D / 細胞壁ミメティックス / ヘミセルロース / アセチル基 / 木化 / 蛍光共鳴エネルギー移動 / キシログルカン |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、先ず、木材から抽出したセルロースとヘミセルロースを用いて、初期細胞壁の構造を模倣した多糖類マトリックスを人為的に再構築する。さらに、このマトリックス中で、ポプラで発見された細胞壁ペルオキシダーゼを用いて、リグニンの形成反応を行う。この形成過程の解析、特に、成長反応過程を“木化”に関与する物質との空間配置と関連させて解析することに因り、リグニンの構造と生成環境との相関を明らかにすることが本研究である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、主に以下の項目について検討を行った。
1.針葉樹の木化におけるガラクトグルコマンナン（GGM）の機能：前年度のHRPの代わりに、木本植物由来ペルオキダーゼのリコンビナント（rCWPO-C）を用いて、人工多糖類マトリックス中での、コニフェリルアルコール（CA）からの人工リグニン（DHP）の形成を調べた。rCWPO-Cを用いると、過酸化水素が存在する如何なる条件でもDHPが生成した。さらに、アセチル基を有するGGM（Ac-GGM）が、DHPの生成を明確に抑制することも分かった。また、Ac-GGMにキシランを吸着させると、DHPの生成量が顕著に増加し、針葉樹の木化におけるキシランとAc-GGMの役割分担が明確になった。
2.実在植物細胞壁存在下でのDHPの生成とその構造：5.5週齢のシロイヌナズナの細胞壁存在下で、二つのモノリグノール類［CAとシナピルアルコール（SA)］の重合を、rCWPO-Cを用いて試みた。SAから得られるDHPは、細胞壁が存在すると、分子量とβ-O-4結合量が減少した。一方、CAから得られるDHPは、細胞壁の存在で、β-O-4結合の割合が3倍に増加した。この結果から、モノリグノールの重合は、その種類に加え、多糖類の有無にも依存することが分かった。
3.小角X線散乱（SAXS）から算出したリグニンの分子量：スギ(針葉樹)、ケヤキ(広葉樹)、タケ(草本類)から、ジオキサン-HClリグニンを抽出した。ポリスチレンを標品とするサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）でこれらの重量平均分子量を求めると、いずれも1800 g/mol程度を示した。光散乱は低分子量体には不向きなために、SAXSと溶液密度から、重量平均分子量を求めた。その結果、スギ11000 g/mol、ケヤキ23900 g/mol、タケ9140 g/molと、SECより大きな分子量を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の主要な目的である「リグニンの成長反応に及ぼすヘミセルロースの機能」について、本年度の研究でほぼ解明できた。rCWPO-Cをもちいた人工リグニン（DHP）形成では、キシランはDHP形成の足場となり、特に、アセチル基が存在すると、量的増加の他に、その粒子径も大きくなる、広葉樹の木化過程を示すことができている。さらに、本年度は、GGMのアセチル基の機能も明らかにして、針葉樹の木化過程も明らかにした。親水性のヘミセルロース中に存在するアセチル基が、多糖類間の相互作用およびリグニン形成に影響を与えることは、部分的な疎水環境、言い換えれば、両親媒的な環境が木化過程に有意な影響を与えていることの証左であり、研究目的の主要部分は、ほぼ満たしていると考えられる。
しかし、オリゴマーレベルの単離リグニンやモデル化合物を巨大分子化させる研究は、まだ、不十分である。b-O-4結合のみから成るリグニンモデルの5量体の高分子化を、ヘミセルロースが存在しない条件で、rCWPO-Cを用いて試みたが、10量体以上の形成は観測されていない。来年度にヘミセルロースの効果が分れば、目的をほぼ満たすので、おおむね順調に進展していると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
来年度は、本年度の成果を基に、以下の研究を発展させる。
1) 広葉樹の木化におけるグルコマンナン（ＧＭ）の機能：本年度の研究で、針葉樹のGGMは、モノリグノールの重合に直接関与するのでなく、重合の足場となるキシランをセルロースに吸着することを仲介する結果が得られた。次年度は、広葉樹においても、GMが広葉樹キシランのセルロースへの吸着を仲介するかについて、検討する。
2) ヘミセルロース存在下でのリグニンモデル化合物の巨大分子化：単分散のリグニンモデル化合物を、アセチル基を有する水溶性キシラン中で、巨大分子化するのかを検証する。
3）モノリグノールの多糖類マトリックスへの拡散：セルロースナノファイバー及びへミセルロース単独のヒドロゲル、加えて、それら両者からならヒドロゲルを作製し、そのゲル中へのモノリグノール拡散を共焦点レーザ顕微鏡で追跡する。可能なら、ゲル両端にモノリグノールを配置して、FRETの可視化を試みる。
4) 小角X線散乱（SAXS）および数種の方法による分子量測定との比較：分子量マーカーによる検量線を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）と、光散乱および溶液密度とSAXSの組み合わせによる分子量測定では、大きく異なることが分かった。そこで、溶液中の回転半径を推測する目的で、SAXSによる測定に加え、SEC-MALS-visocometerによる回転半径の推定も試み、NMRの結果などを加味して、リグニンの溶液中における分子形態を推呈する。
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