初期分泌経路における亜鉛恒常性維持とタンパク質恒常性維持の相関と分子構造基盤

• Project/Area Number: 21H04758
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 稲葉 謙次 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (10423039)
• Project Period (FY): 2021-04-05 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥42,380,000 (Direct Cost: ¥32,600,000、Indirect Cost: ¥9,780,000); Fiscal Year 2023: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000); Fiscal Year 2022: ¥13,130,000 (Direct Cost: ¥10,100,000、Indirect Cost: ¥3,030,000); Fiscal Year 2021: ¥16,120,000 (Direct Cost: ¥12,400,000、Indirect Cost: ¥3,720,000)
• Keywords: 亜鉛 / クライオ電子顕微鏡 / 細胞イメージング / 蛋白質品質管理 / クライオ電顕 / タンパク質品質管理 / ケミカルバイオロジー / ゴルジ体

Outline of Research at the Start

この20年以上もの間に小胞体品質管理に関する研究は大きく発展した一方で、ゴルジ体をも含む広範囲のタンパク質品質管理機構の研究は現在もなお開拓途上である。我々は最近、亜鉛イオンによる小胞体―ゴルジ体を舞台とした全く新しいタンパク質品質管理機構を発見した。本研究では、構造生化学、細胞生物学、ケミカルバイオロジー、プロテオミクスの技術を駆使することにより、この新しいタンパク質品質管理システムの分子機構と生理機能を究明する。これにより、細胞の亜鉛恒常性維持とタンパク質恒常性維持機構の相関を明らかにし、細胞のタンパク質品質管理機構に関する多くの新しい概念を提唱する。

Outline of Annual Research Achievements

2022年度は、ゴルジ体に存在する亜鉛輸送体ZnT4/5/6/7を介した亜鉛恒常性維持機構と、亜鉛依存性分子シャペロンERp44を介したタンパク質恒常性維持機構に関する詰めの研究を行い、論文がNature Communications誌に受理されるに至った。一方これまで、小胞体からサイトゾルに亜鉛を排出する膜輸送体ZIP7の生理機能については十分に理解されていなかったため、ZIP7ノックダウンおよび阻害剤処理の実験を系統的に行った。その結果、ZIP7阻害処理に伴う小胞体内の亜鉛濃度の上昇を観測し、さらにそのことに起因して、ERp44の細胞内局在、トラフィック、およびクライアント滞留活性の変化を観測した。最終的に、小胞体の亜鉛恒常性維持とレドックス恒常性維持が密接に関わっていることを突き止め、現在論文作成に取りかかるところである。
ゴルジ体に存在する亜鉛輸送体ZnT7のクライオ電顕による構造解析も大きく進展し、亜鉛結合状態および非結合状態の両方について、原子分解能に近いレベルで構造を決定することに成功した。興味深いことに、この構造解析により、ZnT7に特徴的な長いヒスチジンループがサイトゾル側で亜鉛イオンをリクルートする様子を捉えることに成功し、ZnT7による亜鉛輸送機構に関する重要な情報が得られ、現在リバイス原稿投稿準備中である。また小胞体の亜鉛輸送体ZIP7についても、大量発現精製系を構築し、それに特異的に結合するナノボディの作製にも成功した。クライオ電顕によるZIP7の構造解析の下地はおよそ出来たと考えている。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

2022年度中に、ZnT4/5/6/7による亜鉛恒常性維持に関する論文がNature Communications誌に受理されたことは、当初の予定通りである。一方、小胞体の亜鉛輸送体ZIP7に関する一連の研究から、小胞体における亜鉛とレドックス間のクロストークに関する発見は当初想定していなかったことであり、細胞生物学分野に大きなインパクトを与える成果であると考えている。また亜鉛輸送体ZnT7のクライオ電顕構造解析についても、この一年間で飛躍的に分解能が向上し、その結果、ZnT7に特徴的なHis-loopの亜鉛リクルートにおける新たな機能的役割が見つかったのも想定外の興味深い発見である。

Strategy for Future Research Activity

小胞体の亜鉛輸送体ZIP7の阻害およびノックダウン時の種々の表現型とメカニズムに関する詰めの実験を行い、完成度の高い論文を一日も早く投稿する。さらにZnT7のクライオ電顕構造解析に関する論文について、追加実験およびリバイス原稿作成がおよそ完了し、今年度早い段階で論文アクセプトまでこぎ着ける。また、ZIP7のクライオ電顕構造解析についても、すでにナノボディの作製は完了しており、ZIP7-ナノボディ複合体を調製し、その構造解析を達成する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] San Raffaele Scientific Institute(イタリア)
• [Int'l Joint Research] San Raffaele Scientific Institute(イタリア)
• [Int'l Joint Research] KBSI(韓国)
• [Journal Article] Cryo-EM structures of human SPCA1a reveal the mechanism of Ca ²⁺ /Mn ²⁺ transport into the Golgi apparatus (2023)
  • Author(s): Chen Zhenghao、Watanabe Satoshi、Hashida Hironori、Inoue Michio、Daigaku Yasukazu、Kikkawa Masahide、Inaba Kenji
  • Journal Title: Science Advances Volume: 9 Issue: 9
  • DOI: 10.1126/sciadv.add9742
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Organelle-Level Labile Zn²⁺ Mapping Based on Targetable Fluorescent Sensors (2022)
  • Author(s): Liu Rong、Kowada Toshiyuki、Du Yuyin、Amagai Yuta、Matsui Toshitaka、Inaba Kenji、Mizukami Shin
  • Journal Title: ACS Sensors Volume: 7 Issue: 3 Pages: 748-757
  • DOI: 10.1021/acssensors.1c02153
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Yuxia Zhang, Chigusa Kobayashi, Xiaohan Cai, Satoshi Watanabe, Akihisa Tsutsumi, Masahide Kikkawa, Yuji Sugita, Kenji Inaba (2022)
  • Author(s): Yuxia Zhang, Chigusa Kobayashi, Xiaohan Cai, Satoshi Watanabe, Akihisa Tsutsumi, Masahide Kikkawa, Yuji Sugita, Kenji Inaba
  • Journal Title: Cell reports Volume: 41 Issue: 10 Pages: 111760-111760
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.111760
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural basis of the conformational and functional regulation of human SERCA2b, the ubiquitous endoplasmic reticulum calcium pump (2022)
  • Author(s): Zhang Yuxia、Inaba Kenji
  • Journal Title: BioEssays Volume: 44 Issue: 7 Pages: 2200052-2200052
  • DOI: 10.1002/bies.202200052
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] クライオ電子顕微鏡がもたらす新しいタンパク質構造の知見 (2022)
  • Author(s): 稲葉 謙次、張 玉霞
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 40 Pages: 213-220
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Functional Interplay between P5 and PDI/ERp72 to Drive Protein Folding. (2021)
  • Author(s): Matsusaki M, Okada R, Tanikawa Y, Kanemura S, Ito D, Lin Y, Watabe M, Yamaguchi H, Saio T, Lee YH, Inaba K, and *Okumura M.
  • Journal Title: Biology Volume: 10 Issue: 11 Pages: 1112-1112
  • DOI: 10.3390/biology10111112
  • NAID: 120007168792
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Ca2+ Regulates ERp57-Calnexin Complex Formation. (2021)
  • Author(s): Tanikawa Y,# Kanemura S,# Ito D, Lin Y, Matsusaki M, Kuroki K, Yamaguchi H, Maenaka K, Lee YH, Inaba K, and *Okumura M.
  • Journal Title: Molecules Volume: 26 Issue: 10 Pages: 2853-2853
  • DOI: 10.3390/molecules26102853
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A unique leucine-valine adhesive motif supports structure and function of protein disulfide isomerase P5 via dimerization (2021)
  • Author(s): Okumura M, Kanemura S., Matsusaki M., Kinoshita M., Saio T., Ito D., Hirayama C., Kumeta H., Watabe M., Amagai Y., Lee Y. H., Akiyama S. and Inaba K.
  • Journal Title: Structure Volume: 29 Issue: 12 Pages: 1-14
  • DOI: 10.1016/j.str.2021.03.016
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Distinct roles and actions of protein disulfide isomerase family enzymes in catalysis of nascent-chain disulfide bond formation (2021)
  • Author(s): Hirayama, C., Machida, K., Noi, K., Murakawa, T., Okumura, M., Ogura, T., Imataka, H., and Inaba, K.*
  • Journal Title: iScience Volume: 4 Issue: 4 Pages: 102296-102296
  • DOI: 10.1016/j.isci.2021.102296
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cryo-EM analysis provides new mechanistic insight into ATP binding to Ca2+-ATPase SERCA2b (2021)
  • Author(s): Yuxia Zhang, Satoshi Watanabe, Akihisa Tsutsumi, Hiroshi Kadokura, Masahide Kikkawa and Kenji Inaba*
  • Journal Title: EMBO Journal Volume: 6 Issue: 19
  • DOI: 10.15252/embj.2021108482
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Visualization of structural dynamics of protein disulfide isomerase enzymes in catalysis of oxidative folding and reductive unfolding (2020)
  • Author(s): Okumura, M., Noi, K. and Inaba, K.*
  • Journal Title: Curr. Opin. Struct. Biol. Volume: 66 Pages: 49-57
  • DOI: 10.1016/j.sbi.2020.10.004
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Molecular basis of redox-, pH-, and metal ion-dependent protein quality control at the ER-Golgi interface (2022)
  • Author(s): Inaba, K.
  • Organizer: KPPS symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular basis of redox- and zinc-dependent protein quality control at the ER-Golgi interface (2022)
  • Author(s): Inaba, K.
  • Organizer: Redox week in Sendai
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular basis of zinc-dependent protein quality control at the ER-Golgi interface (2022)
  • Author(s): Inaba, K.
  • Organizer: 10th Asian Biological Inorganic Chemistry Conference
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Close linkage between redox and zinc homeostasis in the endoplasmic reticulum (2022)
  • Author(s): Amagai, Y., Arai, C., Inaba, K.
  • Organizer: Redox week in Sendai
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Protein Disulfide Isomerase family; their molecular actions and functions (2022)
  • Author(s): Okumura, M. and Inaba, K.
  • Organizer: Redox week in Sendai
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 小胞体とゴルジ体間のコミュニケーションによる新たなタンパク質品質管理機構 (2022)
  • Author(s): 稲葉 謙次
  • Organizer: 第95回日本生化学会
  • Invited
• [Presentation] ERp44を介した亜鉛とレドックスホメオスタシスのクロストーク (2022)
  • Author(s): 天貝 佑太，新井 千尋、稲葉 謙次
  • Organizer: 第22回 日本蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡で明らかになったカーゴ受容体ERGIC-53の柔らかな全長構造 (2022)
  • Author(s): 渡部 聡 木瀬 孔明 米澤 健人 清水 伸隆 濡木 理 稲葉 謙次
  • Organizer: 第22回蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] 小胞体内の亜鉛恒常性維持はPDIファミリー酵素のレドックス制御に重要である (2022)
  • Author(s): 天貝 佑太、新井 千尋、稲葉 謙次
  • Organizer: 第45回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 亜鉛輸送体の機能不全により影響を受ける分泌・膜タンパク質の解析 (2022)
  • Author(s): 大山 莉央、天貝 佑太、幡野 敦、松本 雅記、稲葉 謙次
  • Organizer: 第45回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] PDIファミリータンパク質PDIRの構造機能解析 (2022)
  • Author(s): 東 晃太、松崎 元紀、渡部 聡、稲葉 謙次
  • Organizer: 第45回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 小胞体亜鉛輸送体ZIP7の構造解析 (2022)
  • Author(s): 富岡 竜也、陳 正豪、天貝 佑太、渡部 聡、稲葉 謙次
  • Organizer: 第45回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Structural and mechanistic basis of protein quality control systems in the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus of human cells (2021)
  • Author(s): Inaba, K.
  • Organizer: UST Global mentoring program meeting
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Observing the cotranslational disulfide rearrangement in a cell surface multidomain protein, LDL receptor, in the ER of mammalian cells (2021)
  • Author(s): Kadokura, H., Dazai, Y., Fukuda, Y., Hirai, N., Nakamura, O., and Inaba, K.
  • Organizer: Functional Disulfides in Health & Disease
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 初期分泌経路における亜鉛イオンに依存したタンパク質品質管理機構の分子構造基盤 (2021)
  • Author(s): 稲葉 謙次
  • Organizer: 第５８回日本生化学会北海道支部会
  • Invited
• [Presentation] X線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡単粒子解析がもたらす知見の対比：小胞体カルシウムポンプSERCA2bを例に (2021)
  • Author(s): 稲葉 謙次
  • Organizer: 第一回生命金属科学地方巡業
  • Invited
• [Presentation] 初期分泌経路における亜鉛イオンに依存したタンパク質品質管理機構の分子構造基盤 (2021)
  • Author(s): 稲葉 謙次
  • Organizer: 学術変革領域B「遅延制御超分子化学」 キックオフシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] 哺乳動物細胞分泌経路における亜鉛調節とタンパク質品質管理 (2021)
  • Author(s): 天貝佑太、山田桃、渡邊朝美、小和田俊行、楢本悟史、渡部聡、経塚淳子、Roberto Sitia、水上進、稲葉謙次
  • Organizer: 第62回 日本植物生理学会年会
• [Presentation] 亜鉛に依存したERp44-クライアント複合体の解離機構の解明 (2021)
  • Author(s): 渡部 聡 三宅杏美子 天貝佑太 稲葉謙次
  • Organizer: 第21回蛋白質科学会年会
• [Presentation] 初期分泌経路における亜鉛濃度制御が小胞体―ゴルジ体シャペロンERp44の機能をコントロールする (2021)
  • Author(s): 天貝佑太、山田桃、渡邊朝美、小和田俊行、楢本悟史、渡部聡、経塚淳子、Roberto Sitia、水上進、稲葉謙次
  • Organizer: 第21回 日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Mechanisms of ER-associated degradation pathway mediated by the cooperation of ERdj5 and BiP (2021)
  • Author(s): Cai, X., Ito, S., Noi, K., Inoue, M., Ushioda, R., Nagata, K., and Inaba, K.
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] Elucidating the in vivo oxidative folding mechanism (2021)
  • Author(s): 金村進吾, 奥村正樹, 稲葉謙次
  • Organizer: 第21回 日本蛋白質科学会年会
• [Presentation] 細胞内で翻訳合成途上のLDL受容体にジスルフィド結合が形成される仕組み (2021)
  • Author(s): 門倉 広，平井直也，福田 洋，太宰 結，稲葉謙次
  • Organizer: 第94回日本生化学大会
• [Presentation] Correlative structural analysis of a full-length cargo receptor ERGIC-53 in complex with its partner MCFD2 (2021)
  • Author(s): Watanabe, S., Kise, Y., Yonezawa, K., Shimizu, N., Nureki, O. and Inaba, K.
  • Organizer: 第59回生物物理学会年会
• [Presentation] Cryo-EM analysis provides new mechanistic insight into ATP binding to Ca2+-ATPase SERCA2b (2021)
  • Author(s): Zhang, Y., Watanabe, S., Tsutsumi, A., Kadokura, H., Kikkawa, M., and Inaba, K.
  • Organizer: 第59回日本生物物理年会
• [Presentation] Cryo-EM structure analysis of Secretory Pathway Calcium/Manganese ATPase 1 (SPCA1) (2021)
  • Author(s): Chen, Z., Watanabe, S., Hashida, H., Inoue, M., Tsutsumi, A., Kikkawa, M. and Inaba, K.
  • Organizer: 第59回日本生物物理年会
• [Presentation] ZIP7 regulates the physiological function of ERp44 (2021)
  • Author(s): Arai, C., Amagai, Y., Inaba, K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 全長カーゴ受容体ERGIC-53と補助因子MCFD2との複合体のクライオ電顕構造 (2021)
  • Author(s): 渡部 聡、木瀬孔明、米澤健人、清水伸隆、濡木理、稲葉謙次
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Cryo-EM analysis provides new mechanistic insight into ATP binding to Ca2+-ATPase SERCA2b (2021)
  • Author(s): Zhang, Y., Watanabe, S., Tsutsumi, A., Kadokura, H., Kikkawa, M., and Inaba, K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Mechanisms of ER-associated degradation pathway mediated by the cooperation of ERdj5 and BiP (2021)
  • Author(s): Cai, X., Ito, S., Noi, K., Inoue, M., Ushioda, R., Nagata, K., and Inaba, K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 亜鉛輸送体によって制御されるERp44の小胞体―ゴルジ体輸送 (2021)
  • Author(s): 天貝佑太、稲葉謙次
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Cryo-EM structures of human zinc transporter ZNT7 reveal the mechanism of Zn2+ uptake from the cytosol into the Golgi apparatus (2021)
  • Author(s): Bui, B. H., Watanabe, S., Nomura, N., Iwata, S., Tsutsumi, A., Kikkawa, M., and Inaba K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] 亜鉛結合性シャペロンERp44-基質複合体の形成・解離機構の解明とクライオ電顕構造 (2021)
  • Author(s): 木谷美思、渡部聡、天貝佑太、稲葉謙次
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] ヒト細胞小胞体関連機能の変化を検出するための鋭敏で簡便なレポーターの開発と機能評価 (2021)
  • Author(s): 原田楠子, 八巻 聡, 平井直也, 中村大祐, 河野憲二, 稲葉謙次, 門倉 広
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] Structural analysis of Secretory Pathway Calcium/Manganese ATPase 1 (SPCA1) (2021)
  • Author(s): Chen, Z., Watanabe, S., Hashida, H., Inoue, M., Tsutsumi, A., Kikkawa, M., and Inaba, K.
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Presentation] PDIファミリータンパク質PDIRの構造機能解析 (2021)
  • Author(s): 東晃太、松崎元紀、渡部聡、稲葉謙次
  • Organizer: 第44回 日本分子生物学会年会
• [Book] クライオ電子顕微鏡ハンドブック (2023)
  • Author(s): 渡部 聡 稲葉 謙次
  • Total Pages: 7
  • Publisher: NTS
• [Remarks] 稲葉研究室ホームページ
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/inaba/html/index.html
• [Remarks] ゴルジ体のカルシウムポンプの高分解能構造を決定
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/news_press/20230306/
• [Remarks] 膜ポンプによる膜輸送機構の普遍的概念の提唱
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/news_press/20221207/
• [Remarks] 稲葉研究室ホームページ
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/inaba/html/
• [Remarks] 東北大学生命科学研究科生体分子構造分野
  • URL: https://www.lifesci.tohoku.ac.jp/research/fields/laboratory.html?id=2524
• [Patent(Industrial Property Rights)] タンパク質のフォールディング剤 (2021)
  • Inventor(s): 奥村 正樹、村岡 貴博、岡田 隼輔、稲葉 謙次、松﨑 元紀
  • Industrial Property Rights Holder: 奥村 正樹、村岡 貴博、岡田 隼輔、稲葉 謙次、松﨑 元紀
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2021-033583
  • Filing Date: 2021
  • Acquisition Date: 2021