| Project/Area Number |
21H04760
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University (2024)
The University of Tokyo (2021-2023) |
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Principal Investigator |
一條 秀憲 東京医科歯科大学, 高等研究院, 特別栄誉教授 (00242206)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥41,730,000 (Direct Cost: ¥32,100,000、Indirect Cost: ¥9,630,000)
Fiscal Year 2024: ¥9,620,000 (Direct Cost: ¥7,400,000、Indirect Cost: ¥2,220,000)
Fiscal Year 2023: ¥9,750,000 (Direct Cost: ¥7,500,000、Indirect Cost: ¥2,250,000)
Fiscal Year 2022: ¥11,440,000 (Direct Cost: ¥8,800,000、Indirect Cost: ¥2,640,000)
Fiscal Year 2021: ¥10,920,000 (Direct Cost: ¥8,400,000、Indirect Cost: ¥2,520,000)
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| Keywords | 膜タンパク質品質管理 / TOLLIP / リソソーム / 膜タンパク質 / オートファジー / タンパク分解 / オートファジー・リソソーム系 / 小胞体ストレス / ER-phagy / タンパク質分解 / VPS34 / ERAD |
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| Outline of Research at the Start |
小胞体で合成される膜タンパク質のうち、折りたたみに失敗して生じた不良膜タンパク質は有害であるため、分解されて細胞内から速やかに除去される。このとき、分解基質はプロテアソームへ輸送されて分解されるというのがこれまでの常識であった。しかし我々は最近、ある細胞質タンパク質が小胞体膜上の基質を認識したのちリソソームへ輸送して分解するという、新たな不良膜タンパク質分解経路を発見した。本研究では、このリソソーム分解経路の詳細をゲノムワイドスクリーニングやイメージング解析などを駆使して分子レベルで解明し、膜タンパク質の品質管理という重要な細胞機能を担う、生命の新たな基本原理として提唱することを目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
課題1）TOLLIP依存的な不良膜タンパク質リソソーム分解機構の解析
前年度までの解析の結果、細胞質局在アダプター分子TOLLIPが小胞体に蓄積した様々なフォールディング異常の不良膜タンパク質を認識し、選択的にリソソーム分解へ導くことを明らかにした。本年度は、TOLLIPが認識した不良膜タンパク質基質をどのようにリソソームへと輸送するかを解明するため、BiFC（Bimolecular Fluorescence Complementation）法および光-電子相関顕微鏡法（CLEM）を用いた解析を当研究科機能病態学教室との共同研究として実施した。具体的には、2分割した蛍光タンパク質VenusをTOLLIPと不良膜タンパク質基質とにそれぞれ付加し、基質を認識した状態のTOLLIPのみが蛍光を発するコンストラクトを作成した。この蛍光はリン脂質PI3Pが豊富なpuncta構造と共局在し、このpunctaを電子顕微鏡観察するとエンドソーム様の一層の脂質二重膜で覆われた小胞であることが明らかになった。この結果から、TOLLIPは小胞体膜上の基質を認識したのち、基質とともにPI3Pが豊富な輸送小胞へ移行し、これにより最終的な基質のリソソームへの輸送が促されることが示唆された。さらに以上の研究成果を本年度、国際学術誌にて論文報告した（Hayashi et al., EMBO J, 2023）。
課題2）TOLLIP非依存的なリソソーム分解経路の分子機構の探索
前年度までの解析の結果、Connexin50の白内障変異体をはじめ、TOLLIPに依存せずにリソソーム分解される不良膜タンパク質も多数存在することが明らかになった。そこで本年度は、ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングを実施し、Connexin50変異体のリソソーム分解に必要な因子を13因子同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
TOLLIP依存的な不良膜タンパク質のリソソーム分解機構に関する論文を、本年度中に国際学術誌にて報告することができ（Hayashi et al., EMBO J, 2023）、さらにCRISPR/Cas9スクリーニングで新たな不良膜タンパク質分解制御因子を多数同定できたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
課題1）TOLLIP依存的な不良膜タンパク質のリソソームへの輸送機構
TOLLIPが小胞輸送を用いて不良膜タンパク質基質をリソソームへと輸送することは解明できたが、基質がどのように小胞体から搬出されるかは不明瞭である。ER exit site構成因子やReticulon homology domain (RHD) タンパク質など、小胞体からの出芽を促すような因子がTOLLIP依存的な不良膜タンパク質の搬出に関与するか検討予定である。
課題2）TOLLIP非依存的なリソソーム分解経路の解析
ゲノムワイドCRISPR/Cas9スクリーニングで同定したConnexin50変異体のリソソーム分解に必要な因子群について、基質の選択的認識、小胞体からの搬出、小胞輸送、リソソームでの分解などのうちどのステップに関わるかを詳細に解析する。これにより、TOLLIP非依存的なリソソーム分解経路の全体像の解明を目指す。
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