| Project/Area Number |
21H04763
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
田口 英樹 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (40272710)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥41,990,000 (Direct Cost: ¥32,300,000、Indirect Cost: ¥9,690,000)
Fiscal Year 2023: ¥13,780,000 (Direct Cost: ¥10,600,000、Indirect Cost: ¥3,180,000)
Fiscal Year 2022: ¥13,780,000 (Direct Cost: ¥10,600,000、Indirect Cost: ¥3,180,000)
Fiscal Year 2021: ¥14,430,000 (Direct Cost: ¥11,100,000、Indirect Cost: ¥3,330,000)
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| Keywords | タンパク質 / フォールディング / 翻訳 / プロテオミクス / ライブイメージング |
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| Outline of Research at the Start |
タンパク質の立体構造形成（フォールディング）はあらゆる生命現象に根源的に関わる。アミノ酸配列が立体構造を決定するというドグマに従えば、フォールディングは合成過程である翻訳動態に影響を受けないはずであるが、そうでない場合があることが内外の研究から見えてきた。そこで本研究では、翻訳速度に依存したフォールディング研究を推進し、その普遍性と分子機構を包括的に理解することを目的とする。具体的には、翻訳速度に影響を受けるタンパク質のプロテオームレベルでの同定を通して普遍性を調べるとともに、再構成系と細胞内での翻訳時フォールディングの解析を進めながら分子機構を追究する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
【研究１】翻訳速度に依存したフォールディング：翻訳伸長速度によってフォールディングが影響を受けて、タンパク質の可溶性などが変化しうることが一部明らかになってきた。（研究1－1）本年度は翻訳時フォールディングに関わるシャペロン（Trigger Factor）が細胞内でどのような動態でリボソームと結合しているのかを蛍光相関分光法にて調べる系を立ち上げた（Niwa et al, Front Mol Biosci 2022）。（研究1－2）翻訳伸長速度を人為的に変化させることで、フォールディングを制御する研究を開始した。同義置換で翻訳速度を変えることで細胞内のフォールディング状態に変化が出ることが知られているタンパク質を無細胞翻訳系で合成し、そのフォールディング特性の解析を始めた。
【研究2】生細胞内でのフォールディング可視化と分子機構：近年、ヒトの生細胞内で翻訳過程を実時間でトラッキングする手法が開発されている。本研究では、この手法の開発者との国際共同研究により、生きた細胞内で翻訳に共役したフォールディングを直接可視化することを目標の一つとしている。モデル系として翻訳に伴ってフォールディングすることがわかっているCFTRという疾患関連タンパク質の生細胞内での翻訳のイメージングを実施した。その結果、小胞体上でCFTRの新生ポリペプチド鎖が合成されている状況を生細胞で観察する系を確立した。さらに、疾患に関与するCFTR変異体と野生型CFTRにて、翻訳動態に差が出ることが判明した。フォールディングの生細胞内での可視化に関しては、タンパク質の天然構造を認識するが、変性状態には結合しない抗体断片（構造認識Fab）を入手し、精製した上で特徴付けを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、【研究2】での生細胞内でCFTRフォールディングに関して大きな進展があったことから「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
【研究１】翻訳速度に依存したフォールディング：翻訳伸長速度によってフォールディングが影響を受けうることが最近わかってきたが、その実体は明らかではない。そこで、1－1）翻訳伸長速度を人為的に変化させることで、フォールディングを制御する系を確立する。同義置換で翻訳速度を変えることで細胞内のフォールディング状態に変化が出ることが知られているタンパク質をヒト因子由来の無細胞翻訳系で合成し、そのフォールディング特性を解析する。1－2）合理的にデザインしたタンパク質（人工タンパク質）のフォールディングが細胞内と試験管内翻訳で大きく異なっているという予備的な結果が得られた。この違いが使った翻訳系での翻訳速度の違いに起因する可能性が示唆されたので、翻訳速度に変化を付けるなどして実証する。【研究2】生細胞内でのフォールディング可視化と分子機構：近年、ヒトの生細胞内で翻訳過程を実時間でトラッキングする手法（新生鎖トラッキング）が開発されている。本研究では、この手法の開発者との国際共同研究により、生きた細胞内で翻訳に共役したフォールディングを直接可視化することを目標の一つとしている。具体的には、翻訳に伴ったフォールディングの異常が疾患に関わるタンパク質（CFTR）の生細胞内でのフォールディングの可視化を実現する。前年度までの研究で生細胞内でのCFTRの翻訳の可視化ができるようになり、フォールディングに異常が生じた変異体で差異が見られている。この疾患関連タンパク質の新生鎖トラッキング法の論文発表の準備を進める。さらに、タンパク質の天然構造を認識するが変性状態には結合しない抗体断片（構造認識Fab）を用いて、細胞内でのフォールディングの可視化を試みる。
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