| Project/Area Number |
21H04823
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 53:Organ-based internal medicine and related fields
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
本多 政夫 金沢大学, 保健学系, 教授 (00272980)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
堀本 勝久 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 情報・人間工学領域, 招聘研究員 (40238803)
土居 信英 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 教授 (50327673)
岡田 光 金沢大学, 医薬保健学総合研究科, 特任准教授 (50788916)
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| Project Period (FY) |
2021-04-05 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥41,730,000 (Direct Cost: ¥32,100,000、Indirect Cost: ¥9,630,000)
Fiscal Year 2024: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
Fiscal Year 2023: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
Fiscal Year 2022: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
Fiscal Year 2021: ¥11,700,000 (Direct Cost: ¥9,000,000、Indirect Cost: ¥2,700,000)
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| Keywords | 肝微小環境 / 類洞内皮細胞 / Sema6A / 肝再生 / 線維化 |
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| Outline of Research at the Start |
NASHは脂肪化・炎症・線維化を伴って進行し、肝不全や肝発癌発生の要因となる。本研究では肝微小環境の構造理解に基づく新たな代謝性肝疾患治療の確立を行う。肝類洞内皮で高発現するSema6AはSema6A-PlxnA2シグナルを介して肝星細胞の活性化を抑制し抗線維化治療分子として有用な可能性が示唆される。Sema6Aの肝類洞内皮における本来の生理機能を解き明かすことにより、肝再生機構、肝類洞の細動脈化機構、線維化、炎症の機転を解明する。類洞という肝微小構造の解剖学的特徴を利用し、効果的なSema6Aの投与方法を確立する。さらには、PlxnA2をターゲットとした新たな代謝性肝疾患治療を確立する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
NASHは脂肪化・炎症・線維化を伴って進行し、肝不全や肝発癌発生の要因となる。本申請では、Sema6Aの肝類洞内皮における本来の生理機能を解き明かすことにより、肝再生機構、肝類洞の細動脈化機構、線維化、炎症の機転を解明することを目的とする。また、Sema6Aの発現低下と自律神経系路の分布異常との関連を明らかにし、自律神経制御異常によって引き起こされる肝の代謝障害の機序を解明する。
本年度は肝類洞内皮特異的Sema6A KOマウスに高脂肪食負荷を与え、肝組織の遺伝子発現をscRNA-seqにて解析した。肝星細胞の増加に加え、胆管細胞、クッパー細胞の増加が見られ、未分化な肝類洞内皮細胞の増加も認められた。以上より、Sema6Aは肝類洞内皮細胞及びその周辺細胞の分化に関与していることが示唆された。
PlexinA2特異的に結合する分泌型Sema6aを肝線維化モデルであるPDGF-C Tgマウスに投与すると、迷走神経の求心性伝達が有意に抑制されることが解った。Sema6aの自律神経制御との関連が示唆された。
Sema6A-PlxnA2シグナル関連パスウェイが亢進もしくは抑制される化合物を探索した。その結果、SEMA6A, SEMA3C, PLXNA2, RND3の４つの遺伝子についてそれぞれ17, 18, 15, 17の化合物が出力され、重複を取り除くと33化合物が得られた。
肝細胞選択的なSema6Aのdeliveryシステムの開発に向けて、Sema6A細胞外ドメインのC末に抗ASGR一本鎖抗体scFvを連結する方法について検討し、Sema6AのC末とscFvのC末にそれぞれ別々のペプチドタグを融合したタンパク質をHEK293で発現し、連結可能であることを確認できた。さらに、ヒトASGRとマウスASGR（類似性80％）の両方に結合するVHドメイン抗体を取得することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Sema6Aの肝類洞内皮における本来の生理機能として、内皮の分化や増殖に関わることが示唆された。また、PlexinA2特異的に結合する分泌型Sema6aは、肝線維化形成するPDGF-C tgマウスの迷走神経の求心性伝達を有意に抑制することを見出した。Sema6aは、中枢神経内の生理機能に関与することが知られているが、自律神経系における役割は明らかではない。自律神経特異的PlexinA2 KO（Phox2b-cre/PlexinA2 flox/flox）マウスの作成に取りかかっており、概ね順調に進展している。
申請書記載のSema6A-PlxnA2とSema3C-PlxnA2に関するリン酸化及び遺伝子発現に関する計測を終了し、その計測結果の解析も終了した。その結果、機序に関連する分子群候補（分子刻印及びその有意パスウェイ）の選定、さらにそれら分子群に基づいて治療効果の期待できる既存薬候補を選定した。これらの化合物について性状を調査し、in vivo検証実験の準備を行っている。
当初の計画で予定していたヒトPlxnA2細胞外ドメインに結合するVHドメイン抗体の創出についてはやや遅れているが、その代わりにヒトASGRとマウスASGR（類似性80％）の両方に結合するVHドメイン抗体の創出に成功したこと、また、当初の計画にはなかった2種類のペプチドを共有結合で連結する酵素に着目し、Sema6AとscFvを連結する手法を確立できたことから、計画全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
PlexinA2特異的に結合する分泌型Sema6aは、肝線維化形成するPDGF-C tgマウスの迷走神経の求心性伝達を有意に抑制することを見出した。Sema6aの肝迷走神経に対する効果は、既存の神経伝達阻害剤と比較すると門脈投与してから緩やかに神経伝達を抑制していくことが観察された。Sema6aは、中枢神経内の生理機能に関与することが知られているが、自律神経系における役割は明らかではない。今後、自律神経特異的PlexinA2 KO（Phox2b-cre/PlexinA2 flox/flox）マウスを作成し、NAFLD-NASH病態における解析を進める。
SEMA6A, SEMA3C, PLXNA2, RND3の4つの遺伝子について、重複を取り除くと33化合物が得られた。これらの化合物の検証を行うと共に、独自解析システムによる結果の評価を実行し、既存薬剤解析から見えてくる分子機序仮説を構築する。2006年発表のBroad Instituteが構築した薬剤変動データセット及び、それ以降FDAに承認された薬剤に関する公開データから収集・整備した独自薬剤変動データセットを用いて解析を行う。
前年度に取得したヒトASGRとマウスASGRの両方に結合するVHドメイン抗体とSema6A細胞外ドメインを酵素的に連結したタンパク質を調製し、肝細胞由来培養細胞や初代肝細胞の表面に選択的にdeliveryされることを確認する。さらに、PlxnA2細胞外ドメインに結合するVHドメイン抗体の試験管内選択を完遂し、上記のSema6Aの代わりとして用いることで、ASGRとPlxnA2の両者に結合して抗肝線維化活性を有する二重特異性VHドメイン抗体を創出する。
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