1細胞活性の光，電気，熱計測に基づく食中毒・感染症原因菌の迅速検査法の開発

• Project/Area Number: 21H04963
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
• Research Institution: Osaka Metropolitan University (2022-2024); Osaka Prefecture University (2021)
• Principal Investigator: 椎木 弘 大阪公立大学, 大学院工学研究科, 教授 (70335769)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西野 智昭 東京工業大学, 理学院, 准教授 (80372415) ; 緒方 元気 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 特任准教授 (80452829)
• Project Period (FY): 2021-04-05 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥41,210,000 (Direct Cost: ¥31,700,000、Indirect Cost: ¥9,510,000); Fiscal Year 2024: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000); Fiscal Year 2023: ¥14,430,000 (Direct Cost: ¥11,100,000、Indirect Cost: ¥3,330,000); Fiscal Year 2022: ¥10,400,000 (Direct Cost: ¥8,000,000、Indirect Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2021: ¥5,720,000 (Direct Cost: ¥4,400,000、Indirect Cost: ¥1,320,000)
• Keywords: 検査技術 / 細菌識別 / 細胞活性 / 迅速検査

Outline of Research at the Start

本申請研究では，細胞表面の化学構造に特異的な人工抗体によって標的細胞を捕捉し，細胞の代謝によって消費，生成される化学種や反応熱に基づく光，電気，熱の信号変化をリアルタイム計測する手法を独自に開発する。これらの異なる信号に基づいた細胞情報の取得によって，標的細菌の活性を1細胞レベルで多角的に評価できる非培養系の検出原理を開発する。細菌の識別と活性評価を同時に達成する革新的手法の開発により検査の迅速化を実現し，安心安全で豊かな社会の形成に貢献する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，細菌細胞の活性を多角的に評価する新しい検出原理を開発することを目的として，（１）細菌特異性電極の開発とともに，（２）細胞活性の高感度計測法の開発を行った。
（１）抗体を化学修飾した金属ナノ粒子を作製し，細胞を標識，観察することで金属ナノ粒子の粒径を分解能とした細胞表面解析を行った。抗O157抗体を修飾した金属ナノ粒子は大腸菌O157にのみ結合し，他の血清型大腸菌には結合しなかった。同様に大腸菌O26や黄色ブドウ球菌に特異性をもつ抗体を異なる金属（金，銀，銅）のナノ粒子に導入し，原理確認した。標識した各細胞を暗視野顕微鏡で観察するとナノ粒子の金属種によって異なる光散乱特性が得られ，このことから，粒子と抗体の組み合わせによって菌種の識別が可能になった。そこで，当初計画にはなかった光散乱に基づく細菌検出法の開発と同時に標的細菌の定量についても今後検討を行うこととした。また，導電性高分子PPy膜を電極上で形成する際，重合反応に標的細菌を共存させ，細胞をPPy膜に固定することに成功した。
（２）細菌の生命活動は，細胞内での種々の化学反応によって支えられていることから，これらの化学反応に着目した細胞活性の評価について検討した。細菌分散液での電気化学計測において，好気下では溶存酸素の減少量から細胞の呼吸活性が評価可能であった。しかし，酸素とメナジオン（電子メディエータ）が共存した場合，電流応答が重複し，正確な活性計測が困難であった。そこで，電子メディエータについて再度探索することとした。酸素は細菌活性にとって重要であることから，計測系における溶存酸素の除去は好ましくない。そこで，酸素の電流応答を電位選択的に除外し，かつ選択した電位で電流応答を示すメディエータの選定を行った。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

異なる金属（金，銀，銅）からなるナノ粒子の作製に成功した。これらのナノ粒子が，金属種によって異なる光学特性を示すことを明らかにし，その散乱光が異なる色（白，赤，青）で観察されることを示した。粒子と抗体の組み合わせによって菌種の識別を異なる色で表現できることを見出した。

Strategy for Future Research Activity

当初計画にはなかった光散乱に基づく細菌検出法の開発と同時に標的細菌の定量についても今後検討を行うこととした。

Research Products

• [Journal Article] An electrochemiluminescence resonance energy aptasensor based on Ag3PO4-UiO-66 for ultrasensitive detection of diethylstilbestrol (2023)
  • Author(s): Song Qingyuan、Shan Xueling、Bu Liyin、Dai Anna、Jiang Ding、Wang Wenchang、Shiigi Hiroshi、Chen Zhidong
  • Journal Title: Journal of Electroanalytical Chemistry Volume: 928 Pages: 116987-116987
  • DOI: 10.1016/j.jelechem.2022.116987
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Self-powered photoelectrochemical aptasensor for sensitive detection of Microcystin-RR by integrating TiO2/S-doped Ti3C2 MXene photoanode and MoS2/S-doped Ti3C2 MXene photocathode (2023)
  • Author(s): Zhang Yude、Du Xiaojiao、Wei Meng、Shan Xueling、Wang Wenchang、Jiang Ding、Shiigi Hiroshi、Chen Zhidong
  • Journal Title: Analytica Chimica Acta Volume: 1238 Pages: 340645-340645
  • DOI: 10.1016/j.aca.2022.340645
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Dual-binding domain electrochemiluminescence biosensing platform with self-checking function for sensitive detection of synthetic cathinone in e-cigarettes (2023)
  • Author(s): Cao Qianying、Jiang Ding、Zheng Lingli、Xu Fangmin、Shiigi Hiroshi、Shan Xueling、Wang Wenchang、Chen Zhidong
  • Journal Title: Biosensors and Bioelectronics Volume: 224 Pages: 114963-114963
  • DOI: 10.1016/j.bios.2022.114963
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Electrochemical measurement of microbial activity (2022)
  • Author(s): Ikeda Hikaru、Itagaki Satohiro、Nishii Shigeki、Yamamoto Yojiro、Sadanaga Yasuhiro、Shiigi Hiroshi
  • Journal Title: Review of Polarography Volume: 68 Issue: 1 Pages: 15-25
  • DOI: 10.5189/revpolarography.68.15
  • ISSN: 0034-6691, 1884-7692
  • Year and Date: 2022-05-19
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ternary electrochemiluminescence biosensor based on black phosphorus quantum dots doped perylene derivative and metal organic frameworks as a coreaction accelerator for the detection of chloramphenicol (2022)
  • Author(s): Wen Jing、Jiang Ding、Shan Xueling、Wang Wenchang、Xu Fangmin、Shiigi Hiroshi、Chen Zhidong
  • Journal Title: Microchemical Journal Volume: 172 Pages: 106927-106927
  • DOI: 10.1016/j.microc.2021.106927
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Black phosphorous dots phosphatized bio-based carbon nanofibers/bimetallic organic framework as catalysts for oxygen evolution reaction (2022)
  • Author(s): He Miao-miao、Wang Dan、Shiigi Hiroshi、Liu Chang-hai、Wang Wen-chang、Shan Xue-ling、Chen Zhi-dong
  • Journal Title: International Journal of Hydrogen Energy Volume: 47 Issue: 39 Pages: 17194-17203
  • DOI: 10.1016/j.ijhydene.2022.01.228
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Development of highly sensitive optical nanoantenna for bacterial detection (2022)
  • Author(s): Itagaki Satohiro、Tanabe So、Ikeda Hikaru、Shan Xueling、Nishii Shigeki、Yamamoto Yojiro、Sadanaga Yasuhiro、Chen Zhidong、Shiigi Hiroshi
  • Journal Title: The Analyst Volume: 147 Issue: 11 Pages: 2355-2360
  • DOI: 10.1039/d2an00475e
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Simultaneous Optical Detection of Multiple Bacterial Species Using Nanometer-Scaled Metal?Organic Hybrids (2022)
  • Author(s): Tanabe So、Itagaki Satohiro、Matsui Kyohei、Nishii Shigeki、Yamamoto Yojiro、Sadanaga Yasuhiro、Shiigi Hiroshi
  • Journal Title: Analytical Chemistry Volume: 94 Issue: 31 Pages: 10984-10990
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.2c01188
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Au-doped MOFs catalyzed electrochemiluminescence platform coupled with target-induced self-enrichment for detection of synthetic cannabinoid RCS-4 (2022)
  • Author(s): Cao Qianying、Jiang Ding、Xu Fangmin、Wen Jing、Wang Wenchang、Shiigi Hiroshi、Chen Zhidong
  • Journal Title: Microchimica Acta Volume: 189 Issue: 9 Pages: 313-313
  • DOI: 10.1007/s00604-022-05397-0
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Ultrasensitive self-driven photoelectrochemical aptasensor for lincomycin detection based on oxygen vacancy-tunable BiOBr nanosheet coupled with dual-function of N-doped Ti3C2 quantum dots (2022)
  • Author(s): Wei Meng、Du Xiaojiao、Zhang Yude、Shan Xueling、Wang Wenchang、Chen Yanli、Jiang Ding、Xu Fangmin、Shiigi Hiroshi、Chen Zhidong
  • Journal Title: Biosensors and Bioelectronics: X Volume: 12 Pages: 100266-100266
  • DOI: 10.1016/j.biosx.2022.100266
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A naked-eye colorimetric pH and temperature sensor based on gold nanoparticle-loaded stimuli-sensitive dendrimers (2022)
  • Author(s): C. Kojima, H. Xia, Y. Yamamoto, H. Shiigi
  • Journal Title: ChemNanoMat Volume: 8 Issue: 3 Pages: 20210044-20210044
  • DOI: 10.1002/cnma.202100442
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of an Electrochemical Evaluation for the Respiration of <i>Escherichia coli</i> (2021)
  • Author(s): 田邉 壮，板垣賢広，陶国智史，椎木 弘
  • Journal Title: BUNSEKI KAGAKU Volume: 70 Issue: 12 Pages: 715-719
  • DOI: 10.2116/bunsekikagaku.70.715
  • NAID: 130008162171
  • ISSN: 0525-1931
  • Year and Date: 2021-12-05
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantification of Enterohemorrhagic <i>Escherichia coli via</i> Optical Nanoantenna and Temperature-responsive Artificial Antibodies (2021)
  • Author(s): S. Tanabe, S. Itagaki, S. Sun, K. Matsui, T. Kinoshita, S. Nishii, Y. Yamamoto, Y. Sadanaga, H. Shiigi
  • Journal Title: Analytical Sciences Volume: 37 Issue: 11 Pages: 1597-1601
  • DOI: 10.2116/analsci.21P135
  • NAID: 130008114865
  • ISSN: 0910-6340, 1348-2246
  • Year and Date: 2021-11-10
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ultrasensitive ECL aptasensing of kanamycin based on synergistic promotion strategy using 3,4,9,10-perylenetetracar-boxylic-l-cysteine/Au@HKUST-1 (2021)
  • Author(s): J. Wen, L. Zhou, D. Jiang, X. Shan, W. Wang, H. Shiigi, Z. Chen
  • Journal Title: Analytica Chimica Acta Volume: 1180 Pages: 338780-338780
  • DOI: 10.1016/j.aca.2021.338780
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] 高感度検出用マイクロプレートの開発 (2021)
  • Author(s): 田邉 壮，松井響平，孫 術益，板垣賢広，西井成樹，山本陽二郎，椎木 弘
  • Journal Title: クリーンテクノロジー Volume: 31 Pages: 49-53
• [Journal Article] 金箔がさらにかがやく未来 (2021)
  • Author(s): 椎木 弘
  • Journal Title: someone Volume: 56 Pages: 4-5
• [Presentation] 「微生物センサで食の安全を守る」 (2023)
  • Author(s): 椎木 弘
  • Organizer: 大阪公立大学 イノベーションアカデミーワークショップ
  • Invited
• [Presentation] ローテクでナノテク～ケミストリーのちから～ (2023)
  • Author(s): 椎木 弘
  • Organizer: 医工連携WEBINAR～私たちのシーズ・ニーズ・技術
  • Invited
• [Presentation] 抗体修飾ナノ構造体標識によるバクテリアセンシング (2023)
  • Author(s): 中尾彰宏，中村祥吾，松井響平，西井成樹，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 電気化学会第９０回大会
• [Presentation] 電子伝達体の電気化学特性に着目した細菌活性評価 (2023)
  • Author(s): 池田 光，床並 朗，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 電気化学会第９０回大会
• [Presentation] 分子鋳型ポリマー修飾ダイヤモンド電極によるドキソルビシンの高選択的検出 (2023)
  • Author(s): 石井夏奈子，緒方元気，山本崇史，孫 術益，椎木 弘，栄長泰明
  • Organizer: 電気化学会第９０回大会
• [Presentation] 金ナノ構造体を用いた細菌の光学検出 (2022)
  • Author(s): 板垣賢広，田邉 壮，西井成樹，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 第８２回分析化学討論会
• [Presentation] テトラゾリウム塩の電気化学特性に基づいた細菌検出法の開発 (2022)
  • Author(s): 池田 光，板垣賢広，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 第８２回分析化学討論会
• [Presentation] セルロースナノファイバを用いたフレキシブル電極の開発 (2022)
  • Author(s): 板垣賢広，松井響平，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 第８２回分析化学討論会
• [Presentation] 金属ナノ構造体を用いた細菌一括検出法の開発 (2022)
  • Author(s): 板垣賢広，中村祥吾，中尾彰宏，西井成樹，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: ２０２２年電気化学秋季大会
• [Presentation] テトラゾリウム塩の電気化学特性に着目した細菌活性評価 (2022)
  • Author(s): 池田 光，床並 朗，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: ２０２２年電気化学秋季大会
• [Presentation] セルロースナノファイバを用いたフレキシブル電極の開発 (2022)
  • Author(s): 板垣賢広,松井響平,定永靖宗, 椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第７１年会
• [Presentation] 金属ナノ構造体の電気化学特性を利用した微生物検出 (2022)
  • Author(s): 中尾彰宏，中村祥吾，板垣賢広，西井成樹，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第７１年会
• [Presentation] 「ホルマザン色素の電気化学特性に基づいた生菌計測法」 (2022)
  • Author(s): 池田 光，床並 朗，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第７１年会
• [Presentation] 金属ナノ構造体の光散乱特性に基づく細菌一括検出法の開発 (2022)
  • Author(s): 板垣賢広，田邉 壮，西井 成樹，定永 靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第７１年会
• [Presentation] 微生物における金ナノ粒子生成過程の解析 (2022)
  • Author(s): 中嶋亮裕，板垣賢広，山本陽二郎，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第７１年会
• [Presentation] 金属ナノ構造体を標識とした微生物の電気化学的検出 (2022)
  • Author(s): 中村祥吾，中尾彰宏，板垣賢広，西井成樹，定永 靖宗，椎木 弘 金属ナノ構造体を標識とした微生
  • Organizer: 日本分析化学会第７１年会
• [Presentation] ホルマザン色素の酸化還元反応に 基づいた電気化学的生菌 (2022)
  • Author(s): 池田 光，床並 朗，山本陽二郎，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 第６８回ポーラログラフィーおよび電気分析化学討論会
• [Presentation] 金属ナノ構造体の電気化学特性を 利用した検出法の開発 (2022)
  • Author(s): 中村祥吾，中尾彰宏， 板垣賢広，西井成樹，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 第６８回ポーラログラフィーおよび電気分析化学討論会
• [Presentation] 金ナノ粒子を用いたフレキシブル 電極の開発と電気化学的応用 (2022)
  • Author(s): 板垣賢広，孫 術益， 松井響平，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 第６８回ポーラログラフィーおよび電気分析化学討論会
• [Presentation] テトラゾリウム塩の電気化学に基づいた細胞活性評価 (2022)
  • Author(s): 池田 光，床並 朗，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: ２０２２（令和 ４）年度 生理研研究会「細胞の局所コミュニティ研究会」
• [Presentation] 金ナノ粒子を利用した増感化学センサ技術 (2022)
  • Author(s): 椎木 弘
  • Organizer: 全日本科学技術協会
  • Invited
• [Presentation] ナノめっき法を利用した抗菌材料および微生物計測 (2021)
  • Author(s): 椎木 弘
  • Organizer: 近畿アルミニウム表面処理研究会 春季講演会
  • Invited
• [Presentation] 干渉色アルミニウム作製における交流電解条件の検討 (2021)
  • Author(s): 那脇健太，椎木 弘，野田達夫
  • Organizer: 軽金属学会第140回春期大会
• [Presentation] 金属ナノ粒子がもたらす新しい計測技術 (2021)
  • Author(s): 椎木 弘
  • Organizer: 第81回分析化学討論会
  • Invited
• [Presentation] 金ナノ粒子／セルロースナノファイバ複合膜を用いた汗成分のセンシング (2021)
  • Author(s): 松井響平，保田聖二，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 2021年電気化学秋季大会
• [Presentation] 電気化学，光学活性なナノ構造を標識とした微生物検出法の開発 (2021)
  • Author(s): 田邉 壮，松井響平，板垣賢広，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 2021年電気化学秋季大会
• [Presentation] 干渉色アルミニウム作製における電解時間の影響 (2021)
  • Author(s): 那脇健太，岩本京佳，椎木 弘，野田達夫
  • Organizer: 2021年電気化学秋季大会
• [Presentation] セルロースナノファイバを用いた破れない金箔による汗成分の計測 (2021)
  • Author(s): 松井響平，保田聖二，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第70年会
• [Presentation] 光アンテナ型人工抗体による食中毒菌の可視化と定量法の開発 (2021)
  • Author(s): 田邉 壮，池田 光，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第70年会
• [Presentation] 金属ナノ粒子固定マイクロプレートを用いた細菌の高感度検出 (2021)
  • Author(s): 板垣賢広，松井響平，西井成樹，定永靖宗，椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第70年会
• [Presentation] 交流電解を利用した干渉色アルミニウムの作製 (2021)
  • Author(s): 那脇健太，岩本京佳，椎木 弘，野田達夫
  • Organizer: 日本分析化学会第70年会
• [Presentation] 電気化学的アプローチによる微生物分析 (2021)
  • Author(s): 椎木 弘
  • Organizer: 日本分析化学会第70年会
  • Invited
• [Presentation] 都市大気観測に向けたガス状有機硝酸連続測定装置の改良 (2021)
  • Author(s): 大原 和, 塩路貴大, 河野七瀬, 坂本陽介, 梶井克純, 椎木 弘, 定永靖宗
  • Organizer: 第62回大気環境学会年会
• [Presentation] 交流電解を利用した干渉色アルミニウムの作製 (2021)
  • Author(s): 那脇健太，岩本京佳，椎木 弘，野田達夫
  • Organizer: 第67回ポーラログラフィーおよび電気分析化学討論会
• [Presentation] 微生物計測技術を利用した新型コロナウイルス検出法の開発 (2021)
  • Author(s): 椎木 弘
  • Organizer: 大阪国際感染症研究センターキックオフセミナー
  • Invited
• [Presentation] 能登半島珠洲における大気汚染物質の経年変動解析 (2021)
  • Author(s): 大西佑樹, 松木 篤, 佐藤啓市, 椎木 弘, 定永靖宗
  • Organizer: 2021年度大気環境学会近畿支部研究発表会
• [Presentation] 都市大気観測に向けたガス状有機硝酸測定装置の改良 (2021)
  • Author(s): 塩路貴大, 大原 和, 椎木 弘, 定永靖宗
  • Organizer: 2021年度大気環境学会近畿支部研究発表会
• [Presentation] 2020 年夏季京都市内での実大気観測によるオゾン生成レジームの直接評価 (2021)
  • Author(s): 村岡達也, 定永靖宗, 野尻亮太, 大原 和, 河野七瀬, 黎 珈汝, 坂本陽介, 中嶋吉弘, 佐藤 圭, 加藤俊吾, 中山智喜, 松岡雅也, 椎木 弘, 梶井克純
  • Organizer: 2021年度大気環境学会近畿支部研究発表会
• [Book] 金属ナノ粒子，微粒子の合成，調製と最新応用技術 (2021)
  • Author(s): 松井響平，田邉 壮，板垣賢広，山本陽二郎，椎木 弘
  • Total Pages: 558
  • Publisher: 技術情報協会
  • ISBN: 9784861048623
• [Book] 導電性材料の設計，導電性制御および最新応用展開 (2021)
  • Author(s): 山本陽二郎，藤田昌司，板垣賢広，孫 術益，定永靖宗，椎木 弘
  • Total Pages: 984
  • Publisher: 技術情報協会
  • ISBN: 9784861048678
• [Remarks] 表面計測化学研究グループHP
  • URL: https://www.omu.ac.jp/eng/apchem_10/
• [Remarks] 表面計測化学研究グループHP
  • URL: http://www2.chem.osakafu-u.ac.jp/ohka/ohka12/index.html
• [Patent(Industrial Property Rights)] 「生菌センサ」 (2022)
  • Inventor(s): 椎木 弘，池田 光，床並 朗，西井成樹，山本陽二郎
  • Industrial Property Rights Holder: 公立大学法人大阪
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2022
• [Patent(Industrial Property Rights)] 細菌および／またはウイルスを検出する検出装置、検出方法および標識キット (2021)
  • Inventor(s): 椎木弘
  • Industrial Property Rights Holder: 公立大学法人大阪
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2021-032552
  • Filing Date: 2021