| Project/Area Number |
21H05025
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Broad Section E
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
浅沼 浩之 名古屋大学, 工学研究科, 教授 (20282577)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
根本 直人 埼玉大学, 理工学研究科, その他 (60509727)
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| Project Period (FY) |
2021-07-05 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥190,450,000 (Direct Cost: ¥146,500,000、Indirect Cost: ¥43,950,000)
Fiscal Year 2025: ¥33,020,000 (Direct Cost: ¥25,400,000、Indirect Cost: ¥7,620,000)
Fiscal Year 2024: ¥32,110,000 (Direct Cost: ¥24,700,000、Indirect Cost: ¥7,410,000)
Fiscal Year 2023: ¥27,560,000 (Direct Cost: ¥21,200,000、Indirect Cost: ¥6,360,000)
Fiscal Year 2022: ¥43,550,000 (Direct Cost: ¥33,500,000、Indirect Cost: ¥10,050,000)
Fiscal Year 2021: ¥54,210,000 (Direct Cost: ¥41,700,000、Indirect Cost: ¥12,510,000)
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| Keywords | 人工核酸 / Pre-RNA world / 化学ライゲーション / SNA / L-aTNA / 次世代シーケンサー / PNA |
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| Outline of Research at the Start |
本申請では、１）L-aTNAを”ゲノム”に見立てた自己複製(L-aTNA→L-aTNA)・転写（L-aTNA→DNA(RNA)）・逆転写(DNA(RNA)→L-aTNA)という人工遺伝システムを非酵素的に実現することで、L-aTNAがPre-RNAワールド仮説の候補になりうる原始核酸であることを実証し、さらに２）この人工遺伝システムを活用したL-aTNA人工アプタマー創成へと展開する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、以下の2課題に取り組んだ。
1）金属錯体を利用したL-aTNA鎖のライゲーション効率の向上
2）化学ライゲーションによるL-aTNA配列のDNAへの“転写”による配列解析法の確立
1）Cd2+を使用して、ヒスチジンとの錯形成を行った。BrCNを活性化剤とし、L-aTNA鋳型鎖に対してライゲーション反応を実施した結果、pH 10以上、室温で8時間の反応により90%以上の高い連結率が得られた。さらに、他の2価金属イオン（Mn2+;, Co2+;, Ni2+）との比較検討を行ったところ、Cd2+が最も高い活性を示した。また、ヒスチジン誘導体やヒスタミンなどのリガンドも評価したが、天然アミノ酸であるヒスチジンが最も高い活性を示すことが明らかとなった。次に、イミダゾール基の有効性に着目し、イミダゾールを2分子連結させたN,N-bis(2-imidazoylmethyl)-2-aminoethanolを合成し、その効果を検討したところ、Mn2+存在下において、2時間で80%以上のライゲーションが達成された。
2）L-aTNA配列の読み取り法として、化学ライゲーションを利用したDNAへの“転写”技術の開発を試みた。40merのL-aTNA鎖を鋳型とし、中央20mer領域の配列をDNAで読み取ることを目的とした。具体的には、L-aTNAの末端10merに相補的な20mer DNAを2本設計し、中央部に対応する各10mer部分をランダム化したライブラリーを用いて化学ライゲーションを実施した。その後、NGSでランダム領域の配列を解析したところ、L-aTNAに完全相補な配列が最も高頻度で出現した。2位以下の配列はいずれも1塩基ミスマッチであったが、完全相補配列はそれらに比べ約5倍の出現頻度を示した。以上より、L-aTNA配列20merの読み取りが可能であることを実証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々は、「RNAワールド」に先立ち、L-aTNAが初期の遺伝物質（Pre-RNA）として存在していた可能性があるという仮説のもとに研究を進めている。L-aTNAはL-スレオニンの還元によって得られるジオール骨格を持ち、これは地球初期に存在したと推定されるL-アミノ酸および短鎖ポリペプチドから生成可能である点に着目している。
この仮説に従えば、同時期に存在していた多様なアミノ酸が、L-aTNAの形成や化学ライゲーション反応において補因子として機能していた可能性がある。特に、ヒスチジンが金属イオン（例：Cd2+）と錯体を形成し、化学ライゲーションを効率的に進行させたという本研究の実験結果は、このPre-RNA仮説と整合的である。
さらに、イミダゾール基を2分子連結したリガンド（N,N-bis(2-imidazoylmethyl)-2-aminoethanol）を用いた場合に、従来よりも高いライゲーション効率が得られたことは、初期地球に存在し得たヒスチジンオリゴマーが酵素様に機能した可能性を示唆しており、本仮説を支持する重要な成果である。
また、L-aTNA配列をDNAへと“転写”する化学ライゲーション法を用いた配列解析技術の確立は、本研究の目的の一つである人工セントラルドグマの構築に資するだけでなく、未知の非天然人工核酸の配列解析を可能にする技術的ブレイクスルーである。本年度開発した転写法の精度・効率をさらに向上させることで、L-aTNAアプタマーの取得に向けた実用的な配列解析手法としての展開が期待される。
なお、本手法はL-aTNAに限らず、PNAなど他の人工核酸にも応用可能であることから、幅広い適用性を有する新規配列解析技術としての一般化が可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
2024年度の研究においては、40merのL-aTNA鎖に対し、10merの相補配列と10merのランダム配列からなる20merのDNAを化学ライゲーションによってL-aTNA鋳型上に連結し、次世代シーケンサー（NGS）を用いて配列を解析する手法を確立した。これにより、L-aTNA配列の読み取りに成功した。しかしながら、ランダム配列部の長さが10mer（理論ライブラリー数：4^10＝1,048,576）であるため、各配列あたりのコピー数が少なく、ミスマッチ配列が高頻度で出現する傾向が見られた。実際、NGS解析では完全相補配列が最上位で得られたものの、その出現率は全体の0.25%に留まり、多くは1塩基以上のミスマッチ配列であった。この課題を解決するために、ランダム配列の長さを5mer（ライブラリー数：4^5＝1,024）に短縮することで対象配列ごとのコピー数を増加させ、かつフルマッチとミスマッチ間での融解温度差を拡大する戦略を採用する。具体的には、40merのL-aTNA鎖の両末端10merに対して相補的な2本のDNA 10merをプライマーおよびストッパー鎖として用い、中央部に5merのランダム配列を導入したDNAライブラリーを十分量加えて化学ライゲーションを実施し、L-aTNA鋳型に依存した全長40merのDNA鎖を合成・回収する方法の検討を進めている。
本手法により高精度なL-aTNA配列解析を実現した後に、L-aTNAアプタマーの取得に着手する。具体的には、L-aTNAランダムライブラリーの調製、標的分子との相互作用によるL-aTNAのフィッシング、選抜配列のDNAへの“転写”とPCRによる増幅、NGSによる配列解析、RNAへの転写、さらにL-aTNAへの“逆転写”というサイクルを構築し、アプタマー取得プロセスの実現を目指す。
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| Assessment Rating |
Interim Assessment
A: 順調に研究が進展しており、期待どおりの成果が見込まれる
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