Structural dynamics of GPCR in cells

• Project/Area Number: 21H05037
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Broad Section G
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 濡木 理 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (10272460)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小笠原 諭 千葉大学, 大学院理学研究院, 准教授 (30546685) ; 井上 飛鳥 東北大学, 薬学研究科, 教授 (50525813) ; 藤芳 暁 東京工業大学, 理学院, 助教 (70371705)
• Project Period (FY): 2021-07-05 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥189,280,000 (Direct Cost: ¥145,600,000、Indirect Cost: ¥43,680,000); Fiscal Year 2024: ¥36,790,000 (Direct Cost: ¥28,300,000、Indirect Cost: ¥8,490,000); Fiscal Year 2023: ¥36,790,000 (Direct Cost: ¥28,300,000、Indirect Cost: ¥8,490,000); Fiscal Year 2022: ¥36,790,000 (Direct Cost: ¥28,300,000、Indirect Cost: ¥8,490,000); Fiscal Year 2021: ¥42,120,000 (Direct Cost: ¥32,400,000、Indirect Cost: ¥9,720,000)
• Keywords: GPCR / 生体膜 / クライオ電子顕微鏡

Outline of Research at the Start

GPCRは7回膜貫通型の細胞膜に存在する蛋白質であり、化学物質など外界からの刺激を受容し細胞内にシグナルを伝達する。本研究では、生体膜環境に近い状態に再構成したGPCRの構造をクライオ電子顕微鏡法によって決定し、さらにクライオ蛍光顕微鏡やトモグラフィーを駆使することで、GPCRがどのように細胞にシグナルを伝えているのかを生の状態で可視化する。構造情報を元に、GPCRの活性を操る新規薬剤の開発につなげる。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、さまざまなGPCRを対象に、リガンドと受容体との相互作用やアゴニストの結合様式を解明し、それらがシグナル伝達や生理学的特性にどのように関与しているかの解明を目的としている。特に、交感神経を司るβアドレナリン受容体のうち、β1とβ2受容体は2007年頃の最初期に構造が決定されたGPCR研究のファーストランナーだったが、それから14年もの間、β3受容体の構造だけは報告されていなかった。そこで我々はヒトではなくイヌ由来β3受容体が構造解析に最適であることを見出し、過活動膀胱治療薬ミラベグロンが結合した構造を報告し、薬剤の選択性の分子基盤を明らかにできた。PTH1Rについては、PTH結合型とPTHrP結合型のPTH1Rの構造をCryo-EMで決定し、比較することで、リガンドとレセプターの相互作用の違いやリガンドの親和性や選択性の違いを明らかにした。PTHとPTHrPの結合した5つの構造から、リガンドが受容体から解離するユニークで複雑な過程を理解し、PTHとPTHrPが引き起こすシグナル伝達の異なる持続時間を解明した。
また個々のGPCR構造解析だけではなく、周辺の要素技術の開発も進んでおり、これは当初の想定以上の成果である。まず、簡便なナノディスク再構成法が開発され、これによりオンカラムで迅速かつ高純度に膜タンパク質の精製が可能になった。また、オンカラム中で高効率にナノディスク化した膜タンパク質の精製プロトコルが確立され、これにより従来の方法よりも迅速かつ効率的な解析が可能になった。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

本研究では、さまざまなGPCRを対象に、リガンドと受容体との相互作用やアゴニストの結合様式を解明し、それらがシグナル伝達や生理学的特性にどのように関与しているかを解明した。これらの業績を代表研究者濡木がラストオーサーとして、Nature誌を含む7報の論文としてまとめており、卓越した研究成果をあげているといえる。特に、交感神経を司るβアドレナリン受容体のうち、β1とβ2受容体は2007年頃の最初期に構造が決定されたGPCR研究のファーストランナーだったが、それから14年もの間、β3受容体の構造だけは報告されていなかった。そこで我々はヒトではなくイヌ由来β3受容体が構造解析に最適であることを見出し、過活動膀胱治療薬ミラベグロンが結合した構造を報告し、薬剤の選択性の分子基盤を明らかにできた。PTH1Rについては、・PTH結合型とPTHrP結合型のPTH1Rの構造をCryo-EMで決定し、比較することで、リガンドとレセプターの相互作用の違いやリガンドの親和性や選択性の違いを明らかにした。
PTHとPTHrPの結合した5つの構造から、リガンドが受容体から解離するユニークで複雑な過程を理解し、PTHとPTHrPが引き起こすシグナル伝達の異なる持続時間を解明した。
PTH1Rに結合するアゴニストとの複合体の構造機能解析に成功し、細胞内側に結合するバイアスアゴニストPCO371の作用機構を明らかにした。これにより、特定のシグナル伝達経路を優先的に調節する方法が提案された。

Strategy for Future Research Activity

今後は、標的GPCRのナノディスク環境での複合体の構造を網羅的に解析し、界面活性剤環境下との構造や構造多型の違いを解析する。特筆すべき点は、界面活性剤環境下で観察されたPTH1Rの構造多型がナノディスク環境でも観察されるかや、脂質受容体の場合内在性脂質アゴニストのセカンダリー結合サイトが存在するか、等である。計画に含んでいた、唯一の機械刺激受容体GPCRであるGPR68の構造解析にも取り組む。機械刺激膜蛋白質は脂質との相互作用が活性化に重要であり、脂質構成によって活性が大きく変わるため、GPR68を様々な組成の脂質を用いてナノディスクに再構成し、Gq蛋白質との複合体形成能を網羅的に検討する。複合体が形成できた場合は、Cryo-EMを用いて構造解析を行い、機械刺激によるGPR68の活性化機構を解明する。ナノディスク環境出られたGPCR構造を元に分担者の井上飛鳥教授と共同で機能解析を行い、構造から得られた知見を実証する。
脂質受容体ヘテロダイマーについては生理的な機能なども不明であり、共役するGタンパク質も分からない状況にあるため、まずはヘテロダイマーの精製産物を用いて共役するGタンパク質をin vitroで探索する。分担者の井上飛鳥と共同で、細胞アッセイによってLPA1とS1P1共発現による機能への影響も検証する。さらに、Gタンパク質との複合体の再構成系の構築に取り組み、最終的には精製産物を用いてクライオ電子顕微鏡による単粒子解析を実施し、ヘテロダイマーの構造情報取得を目指す。

Assessment Rating

Interim Assessment Comments (Rating)

A+: In light of the aim of introducing the research area into the research categories, more progress has been made in research than expected.

Research Products

• [Journal Article] Phototrophy by Antenna-Containing Rhodopsin Pumps in Aquatic Environments (2023)
  • Author(s): Chazan, Das, Fujiwara, Murakoshi, Rozenberg, Molina-Marquez, Sano, Tanaka, Gomez-Villegas, Larom, Pushkarev, Malakar, Hasegawa, Tsukamoto, Ishizuka, Konno, Nagata, Mizuno, Katayama, Abe-Yoshizumi, Ruhman, Inoue, Kandori, Leon, Shihoya, Yoshizawa, Sheves, Nureki, Beja
  • Journal Title: Nature Volume: 615 Issue: 7952 Pages: 535-540
  • DOI: 10.1038/s41586-023-05774-6
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Lateral access mechanism of LPA receptor probed by molecular dynamics simulation. (2022)
  • Author(s): Suenaga R, Takemoto M, Inoue A, Ishitani R＊, Nureki O＊
  • Journal Title: PLoS. One. Volume: 17 Issue: 2 Pages: e0263296-e0263296
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0263296
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cryo-EM structures of the β3 adrenergic receptor bound to solabegron and isoproterenol (2022)
  • Author(s): Nureki Ikko、Kobayashi Kazuhiro、Tanaka Tatsuki、Demura Kanae、Inoue Asuka、Shihoya Wataru、Nureki Osamu
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 611 Pages: 158-164
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.04.065
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Endogenous ligand recognition and structural transition of a human PTH receptor (2022)
  • Author(s): Kobayashi Kazuhiro、Kawakami Kouki、Kusakizako Tsukasa、Miyauchi Hirotake、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Shihoya Wataru、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kato Hideaki E.、Inoue Asuka、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 82 Issue: 18 Pages: 3468-3483
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.07.003
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Pharmacophore-guided Virtual Screening to Identify New β3 -adrenergic Receptor Agonists (2022)
  • Author(s): Ujiantari NSO, 他 3 名, Nureki O(5 番目), Hutchinson DS, Schuster D
  • Journal Title: Mol. Inform. Volume: 41 Issue: 7
  • DOI: 10.1002/minf.202100223
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell-Free Synthesis of Human Endothelin Receptors and Its Application to Ribosome Display (2022)
  • Author(s): Nakai Hiroki、Isshiki Kinuka、Hattori Masato、Maehira Hiromasa、Yamaguchi Tatsumi、Masuda Keiko、Shimizu Yoshihiro、Watanabe Takayoshi、Hohsaka Takahiro、Shihoya Wataru、Nureki Osamu、Kato Yasuhiko、Watanabe Hajime、Matsuura Tomoaki
  • Journal Title: Analytical Chemistry Volume: 94 Issue: 9 Pages: 3831-3839
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.1c04714
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure of the type V-C CRISPR-Cas effector enzyme (2022)
  • Author(s): Kurihara Nina、Nakagawa Ryoya、Hirano Hisato、Okazaki Sae、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Scott David A.、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 82 Issue: 10 Pages: 1865-1877
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.03.006
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cryo-EM structures of thylakoid-located voltage-dependent chloride channel VCCN1 (2022)
  • Author(s): Hagino Tatsuya、Kato Takafumi、Kasuya Go、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Hamamoto Shin、Sobajima Tomoaki、Fujiwara Yuichiro、Yamashita Keitaro、Kawasaki Hisashi、Maturana Andr?s D.、Nishizawa Tomohiro、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 2505-2505
  • DOI: 10.1038/s41467-022-30292-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structure of the Dicer-2-R2D2 heterodimer bound to a small RNA duplex (2022)
  • Author(s): Yamaguchi Sonomi、Naganuma Masahiro、Nishizawa Tomohiro、Kusakizako Tsukasa、Tomari Yukihide、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Volume: 607 Issue: 7918 Pages: 393-398
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04790-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Structural insights into inhibitory mechanism of human excitatory amino acid transporter EAAT2 (2022)
  • Author(s): Kato Takafumi、Kusakizako Tsukasa、Jin Chunhuan、Zhou Xinyu、Ohgaki Ryuichi、Quan LiLi、Xu Minhui、Okuda Suguru、Kobayashi Kan、Yamashita Keitaro、Nishizawa Tomohiro、Kanai Yoshikatsu、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 4714-4714
  • DOI: 10.1038/s41467-022-32442-6
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure and engineering of the minimal type VI CRISPR-Cas13bt3 (2022)
  • Author(s): Nakagawa Ryoya、Kannan Soumya、Altae-Tran Han、Takeda Satoru N.、Tomita Atsuhiro、Hirano Hisato、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Zhang Feng、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 82 Issue: 17 Pages: 3178-3192
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.08.001
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structure of the active Gi-coupled human lysophosphatidic acid receptor 1 complexed with a potent agonist (2022)
  • Author(s): Akasaka Hiroaki、Tanaka Tatsuki、Sano Fumiya K.、Matsuzaki Yuma、Shihoya Wataru、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1038/s41467-022-33121-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cryo-EM structures of thermostabilized prestin provide mechanistic insights underlying outer hair cell electromotility (2022)
  • Author(s): Futamata Haon、Fukuda Masahiro、Umeda Rie、Yamashita Keitaro、Tomita Atsuhiro、Takahashi Satoe、Shikakura Takafumi、Hayashi Shigehiko、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Homma Kazuaki、Nureki Osamu
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 6208-6208
  • DOI: 10.1038/s41467-022-34017-x
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cryo-EM structure of the β3-adrenergic receptor reveals the molecular basis of subtype selectivity. (2021)
  • Author(s): Nagiri, C., Kobayashi, K., Tomita, A., Kato, M., Kobayashi, K., Yamashita, K., Nishizawa, T., Inoue, A., Shihoya, W. and Nureki, O.
  • Journal Title: Mol. Cell Volume: 81 Issue: 15 Pages: 3205-3215
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.06.024
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cryo-EM structure of the human MT1-Gi signaling complex. (2021)
  • Author(s): Okamoto, H. H., Miyauchi, H., Inoue, A., Raimondi, F., Tsujimoto, H., Kusakizako, T., Shihoya, W., Yamashita, K., Suno, R., Nomura, N., Kobayashi, T., Iwata, S., Nishizawa, T. and Nureki, O.
  • Journal Title: Nat. Struct. Mol. Biol. Volume: 28 Issue: 8 Pages: 694-701
  • DOI: 10.1038/s41594-021-00634-1
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Structural basis of gating modulation of Kv4 channel complexes. (2021)
  • Author(s): Kise Y, Kasuya G, Okamoto HH, Yamanouchi D, Kobayashi K, Kusakizako T, Nishizawa T, Nakajo K, Nureki O.
  • Journal Title: Nature Volume: 599 Issue: 7883 Pages: 158-164
  • DOI: 10.1038/s41586-021-03935-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cryo-EM reveals mechanistic insights into lipid-facilitated polyamine export by human ATP13A2. (2021)
  • Author(s): Tomita, A., Daiho, T., Kusakizako, T., Yamashita, K., Ogasawara, S., Murata, T., Nishizawa, T. and Nureki, O.
  • Journal Title: Mol. Cell Volume: 81 Issue: 23 Pages: 4799-4809
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.11.001
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Dynamics of Class B GPCRs (2023)
  • Author(s): Osamu Nureki
  • Organizer: GPCR Workshop 2023
• [Presentation] Transporters and Channels Maintain the Plant Homeostasis in/by Photosynthesis” Osamu Nureki (2023)
  • Author(s): Osamu Nureki
  • Organizer: IWPMB2023
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Structural Basis for the Mechanisms of Wide Substrate Specificity and Their Transport of a ABC transporter (2023)
  • Author(s): Osamu Nureki
  • Organizer: Gordon Research Conference ;Targeting the Mechanisms and Regulation of Transporters for Advancing Health During a Pandemic
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural basis for moleculer mechanisms of P4 flippase and P5 polyamine transporter (2022)
  • Author(s): Osamu Nureki
  • Organizer: Symposium on Membrane protein Production and Analysis
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] “Structural basis for molecular mechanisms of CRISPR-Cas and development of novel genome-editing tools towards gene therapy” “Functional dynamics of membrane transporter and receptor” (2022)
  • Author(s): Osamu Nureki
  • Organizer: 19h Course of the International School for Biological Magnetic Resonance
• [Presentation] Cryo-EM structures elucidate the lipid transport cycle of the P4-ATPase flipase (2022)
  • Author(s): Osamu Nureki
  • Organizer: 16th International Conference on Na,K-ATPase and related Transport ATPases
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 膜タンパク質と非翻訳 RNA の分子機構の構造基盤 (2022)
  • Author(s): Osamu Nureki
  • Organizer: 生物物理学会
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Time-resolved serial femtosecond crystal of channeldopsin and design of novel optogenetics tools (2022)
  • Author(s): Osamu Nureki
  • Organizer: 19th International Conference on Retinal Proteins
  • Int'l Joint Research
• [Book] 医学のあゆみ (2021)
  • Author(s): 志甫谷渉・濡木理
  • Total Pages: 7
  • Publisher: 医歯薬出版
  • ISBN: 2105578160
• [Patent(Industrial Property Rights)] Engineered small Cas13bt3 with enhanced activity (2022)
  • Inventor(s): 濡木理、西増弘志、中川綾哉
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人東京大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2022
  • Overseas
• [Patent(Industrial Property Rights)] 膜タンパク質のC末端に付加した His-tag に 対する高親和性モノクローナル抗体 (cHis8) (2022)
  • Inventor(s): 小笠原 諭、村田 武士
  • Industrial Property Rights Holder: 国立大学法人千葉大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2022
  • Acquisition Date: 2022
• [Funded Workshop] GPCR Workshop 2023 (2023)