| Project/Area Number |
21H05041
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Broad Section G
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
宮脇 敦史 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, チームリーダー (80251445)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安藤 亮子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 研究員 (10706170)
平野 雅彦 国立研究開発法人理化学研究所, 光量子工学研究センター, 技師 (90601245)
陣崎 雅弘 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (80216259)
阪上ー沢野 朝子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 研究員 (90462689)
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| Project Period (FY) |
2021-07-05 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥165,490,000 (Direct Cost: ¥127,300,000、Indirect Cost: ¥38,190,000)
Fiscal Year 2025: ¥32,890,000 (Direct Cost: ¥25,300,000、Indirect Cost: ¥7,590,000)
Fiscal Year 2024: ¥32,630,000 (Direct Cost: ¥25,100,000、Indirect Cost: ¥7,530,000)
Fiscal Year 2023: ¥32,370,000 (Direct Cost: ¥24,900,000、Indirect Cost: ¥7,470,000)
Fiscal Year 2022: ¥32,890,000 (Direct Cost: ¥25,300,000、Indirect Cost: ¥7,590,000)
Fiscal Year 2021: ¥34,710,000 (Direct Cost: ¥26,700,000、Indirect Cost: ¥8,010,000)
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| Keywords | バイオイメージング技術 / 蛍光タンパク質 / brightness / photostability / 蛍光標識技術 / brightnes / Brightness / Photostability / 褪色 / 光安定性 / 細胞小器官 / 超解像顕微鏡 / 小胞体 / ミトコンドリア |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、蛍光タンパク質におけるbrightness対photostabilityのトレードオフの打破を企図し、我々が作製した新規蛍光タンパク質をベースに、質的に明るくかつ褪色しない蛍光標識技術を開発することを目的とする。蛍光タンパク質の発現量を抑えたサンプルの調製、励起および照明を最適化した光学技術を総合し、生理的かつ定量的で再現性のあるSustainable fluorescence imagingに近づく技術の確立を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでに光安定性の非常に高い緑色蛍光タンパク質StayGoldを開発している。StayGoldは高い蛍光輝度も併せ持つ非常に優れた蛍光タンパク質であるが、2量体を形成するという欠点がある。そのため生体膜や機能タンパク質のラベリングへの応用に制限があった。StayGoldの２量体を解消しmonovalentな（1価の）タグとするために２つのアプローチを試みた。第一にタンデムダイマーのStayGold(tdStayGold)の開発である。様々な配列（長さ、アミノ酸組成）のペプチドリンカーを持つtdStayGoldを作製し、分散性（monovalent性）をOSER (organized smooth endoplasmic reticulum)法により検証した。その結果、分散性が大いに改善され且つ明るいタンデムダイマーを開発することに成功した。いずれのtdStayGoldも光安定性は元のStayGoldと比較して遜色がなかった。tdStayGoldのmonovalent性を利用して2つの応用を行った。1つは、ゲノム編集による、tdStayGoldとコンデンシンI融合タンパク質のノックイン細胞の樹立である。細胞分裂期の開始に伴い、コンデンシンⅠが細胞質から染色体へダイナミックに局在を変化することを観察した。2つ目は、ゴルジ体膜の可視化である。微小管に沿った小胞状およびチューブ状の膜構造のダイナミクスを明らかにした。第二のアプローチはStayGoldの単量体化である。StayGoldの2量体化に関与すると予想される複数のアミノ酸に様々な組み合わせをもって変異を導入し、元のStayGoldの明るさや光安定性を損なわない単量体StayGold (mStayGold)を得た。mStayGoldでミトコンドリア内膜をラベリングし、高時間分解能のクリステダイナミクス解析に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2022年度の計画の1つとしてStayGoldのmonovalent化およびその応用を以下の通り掲げた。「StayGold遺伝子をタンデムに連結しtdStayGoldを作製する。また結晶構造データを元に２量体界面にあるアミノ酸の置換によって実用的な単量体mStayGoldを作製する」。また融合タンパク質作製の改善に向けて以下の計画を立てた。「StayGoldのN末端およびC末端は比較的短く、他の分子に連結しにくい短所を有する。StayGoldの両末端を改変して、連結耐性の変異体を作製する。tdStayGoldやmStayGoldにコンデンシンなどのクロマチン制御分子を融合し、融合遺伝子をゲノム編集技術を使って培養細胞に導入（ノックイン）する。改変体の性能をwide-field microscopyにて評価する」。2022年度において、tdStayGoldおよびmStayGoldの開発し、monovalent化の計画を達成した。また、StayGoldに新たなN末端、C末端配列を付加・修飾することにより、機能タンパク質（コンデンシンI）や生体膜（ゴルジ体膜、ミトコンドリア内膜）のラベリングを可能とした。様々な励起と照明のモード下でのStayGold観察に関する計画については、共焦点顕微鏡など様々な励起・照明モードにおけるStayGoldの光安定性について体系的解析を行い、計画を達成した。StayGoldの高い光安定性のメカニズムの解明については、2022年度の計画として以下の通り記載した。「発色団前駆体と酸素分子との相互作用、および形成された発色団と酸素分子との相互作用について考察する」。結晶構造データに基づき、解析・考察を進めたものの、高い光安定性の解明には至っていない。
以上の理由から、2022年度における進捗状況に関しては「概ね順調に進展している」と評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
StayGoldの高い光安定性のメカニズム解析について、結晶構造解析データに基づいた考察を引き続きすすめる。同時に新たなStayGold変異体を作製し、その光安定性を調査する。変異体の光安定性情報と構造データとを照らし合わせて解析することにより光安定性のメカニズムの解明を目指す。
StayGoldのN末、C末が比較的短く、他の分子と融合しにくいという短所があった。StayGoldの両末端に様々なペプチド配列を付加、検討することにより、その短所は克服しつつある。その結果として生体膜やコンデンシンIのラベリングに成功している。しかし、採用したN末端、C末端ペプチド配列が最適ではない可能性がある。tdStayGoldやmStayGoldに連結するパートナー分子として、核局在タンパク質を中心に試し、現行のN末、C末配列が広く適用可能であるか検討する。局在や明るさに不具合が観察され次第、StayGold末端配列の改良を行う。明るく局在する融合タンパク質に関しては、細胞生物学的研究を行う。従来のレンジを超えた時空間領域での新しい知見を得るべく詳細に観察を行う。照明モードとしては single-beam laser-scanning confocal microscopy, spinning disk (multi-beam) confocal microscopy, super-resolution SIM (structured illumination microscopy), light-sheet microscopyを用いる。
以上の試みの積み重ねで蓄積される大容量画像データを、効率よく処理するためのデータ保存基盤、データ転送ネットワーク基盤、解析コンピュータ基盤を整備する。
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| Assessment Rating |
Interim Assessment Comments (Rating)
A: In light of the aim of introducing the research area into the research categories, the expected progress has been made in research.
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