| Project/Area Number |
21H05047
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Review Section |
Broad Section I
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
江藤 浩之 京都大学, iPS細胞研究所, 教授 (50286986)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 壮 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点講師 (50769833)
末次 志郎 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (70345031)
杉本 直志 京都大学, iPS細胞研究所, 特定拠点准教授 (10447956)
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| Project Period (FY) |
2021-07-05 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥188,890,000 (Direct Cost: ¥145,300,000、Indirect Cost: ¥43,590,000)
Fiscal Year 2024: ¥34,840,000 (Direct Cost: ¥26,800,000、Indirect Cost: ¥8,040,000)
Fiscal Year 2023: ¥34,840,000 (Direct Cost: ¥26,800,000、Indirect Cost: ¥8,040,000)
Fiscal Year 2022: ¥44,070,000 (Direct Cost: ¥33,900,000、Indirect Cost: ¥10,170,000)
Fiscal Year 2021: ¥42,120,000 (Direct Cost: ¥32,400,000、Indirect Cost: ¥9,720,000)
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| Keywords | 造血システム / 血小板 / 巨核球 / 乱流 / 培養槽 / バイオリアクター / 脂質膜 / iPS細胞 |
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| Outline of Research at the Start |
ヒトiPS細胞由来巨核球からの人工血小板の製造システムを活用し、血小板産生場であるヒト巨核球の脂質二重膜が乱流シグナルを通じて時空間的に多様的・不均一に再構成され、最終的に脂質二重膜が切断されるまでの複雑な血小板産生分子メカニズムを理解する。具体的には、巨核球の成熟多様性における物理刺激の複数のセンシング受容体の使い分け機構や、血小板活性化機能を保持したまま脂質膜の切断が行われる精巧な分子機構を明らかにして新しい造血概念を提唱し、見出した新知見を活用することで産生効率を飛躍的に向上させた人工血小板製造の新規培養システムを開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、血小板産生場であるヒト巨核球の脂質二重膜が乱流シグナルを通じて時空間的に多様的・不均一に再構成され、最終的に脂質二重膜が切断されるまでの複雑な血小板産生分子メカニズムを明らかにすることを提案している。初年度では、巨核球の成熟多様性における物理刺激の複数のセンシング受容体の使い分け機構や、血小板活性化機能を保持したまま脂質膜の切断様式を決定する重要な分子の同定を進めることを目標にした。その結果、巨核球細胞膜表面に見出されるcilia(繊毛)構造体が“乱流センサー”であるとする当初の強い仮説を支持する結果が得られず、様々な検証から典型的なcilia構造とは異なる微絨毛やフィロポディアのような細胞突起であるとの結論に至った。一方で、cilia構造に重要なヘッジホッグシグナリングが血小板産生に重要であることを見出した。ヘッジホッグ分子は、微絨毛やフィロポディアのような細胞突起を通じて分泌されることが明らかになっているためその関連性を検証していく。また、ミトコンドリアの機能維持に関わるミトコンドリア特異的分子として知られているタンパク質が、血小板放出のタイミングでは成熟巨核球の細胞膜に移動し、脂質二重膜構造体の構造変化に関与する可能性が得られた。次に、巨核球細胞膜が切断されて発生する血小板産生時の膜切断機構に関し、切断活性を示す新たな候補分子を同定できた。以上の一連の分子機構を担う候補分子の発見に伴い、これらを標的にした検証実験が開始された。他方、新規の培養機器開発の一端としてGMP基準乱流刺激縦型可動式培養槽を先ず５０Lスケールで機能的な血小板産生が可能かの検証を進め、50L規模でも乱流エネルギー及びせん断ずり応力が至適な値を示すことを実証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
巨核球成熟過程の時間的な変化に伴い、異なる乱流センサーが存在することが予備実験から見出されていたが、最も重要と考えていたcilia構造体に関しては典型的なciliaとは異なることを確認できた。次に、新たに突起様構造体の意味付けを考察するようになった。複数の候補分子、構造体を一つ一つ、(i)タンパクレベルでの発現確認と電子顕微鏡確認、(ii)発現抑制（ノックダウンまたはノックアウト）に伴う巨核球成熟度（ミトコンドリアの細胞内分布とその定量、脂質膜解析、多核化測定、demarcation membrane systemの電子顕微鏡確認）、血小板産生数の定量、を網羅的に検証しており、データの集積目標は達成できた。
分担研究者も研究代表者らが見出した巨核球由来の複数の脂質膜切断タンパクに関し、人工脂質膜（リポソーム）を用いてその膜変形能力、膜切断活性を検証した。
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| Strategy for Future Research Activity |
乱流刺激の中で同定された最適値の乱流エネルギー、せん断ずり応力刺激が存在すると巨核球成熟と脂質膜切断が促進される現象が培養槽の拡大にも応用できることを2021年度までに明らかにした。一方で、１０Lスケールでの血小板産生能に比し、さらなる大型化ではやや低下する傾向が認められた。この原因として、乱流渦のさらに詳細な解析が必要と考えられたことから、新たに実験を追加して解析する。
加えて、２年目の重要な目標である巨核球の脂質二重膜構造体切断機構の分子レベルでの行動様式を解明するために、候補分子のリコンビナントタンパク質の合成とリポソームをモデルにした膜変形能力、膜切断活性の検証実験を進めていく。
2021年度に見出したcilia構造において機能するヘッジホッグシグナルは、微絨毛やフィロポディアのような細胞突起を通じて分泌されることが明らかになっている。フィロポディアは、細胞外小胞となりうることを分担者らが見出しており、血小板産生に関わる現象の原因検索も進める。その際、乱流センサーとカルシウム、カリウム、などのイオン電流との関係性に関しても予備実験データに基づいてその制御機構解明を行っていく。
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| Assessment Rating |
Interim Assessment Comments (Rating)
A: In light of the aim of introducing the research area into the research categories, the expected progress has been made in research.
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