Investigation into the regulatory mechanism of RNA silencing activity by Argonaute Aggregation

Research Project

Project/Area Number	21J11218
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Review Section	Basic Section 43040:Biophysics-related
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	成田晴香東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC2)
Project Period (FY)	2021-04-28 – 2023-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2022: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000) Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Keywords	タンパク質凝集 / アミロイド様凝集 / プリオン様タンパク質 / RNAサイレンシング
Outline of Research at the Start	アルゴノートは、RNAサイレンシングにおいて中心的な役割を担うタンパク質である。ショウジョウバエアルゴノート2には機能未知なN末端配列が存在する。本領域の欠損はRNAサイレンシング活性自体を損なわないことが生化学実験で示されている一方で、N末端変異体のショウジョウバエ個体ではRNAサイレンシング活性に異常を示すことから、私はN末端が細胞内でRNAサイレンシング活性の調節を担うのではないかと着目した。私はこれまでにN末端がプリオン様ドメインであると実験的に示す事に成功している。この観点に基づき、本研究ではN末端を介したアルゴノートの凝集によるRNAサイレンシング活性調節機構の解明を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	ショウジョウバエアルゴノート2（DmAgo2）は機能未知なN末端領域を持つ。本研究ではこれまでに本領域がアミロイド繊維へと凝集するプリオン様ドメインであることを実証し、N-terminal Argonaute Prion-like (NAP)ドメインと名付けた。本年度は、昨年度に蛍光顕微鏡観察によって明らかにしたNAPドメインの多様な凝集状態について、電子顕微鏡を用いてより詳細な構造を明らかにした。その結果、繊維状凝集体は一般的なアミロイド繊維よりも太い幅を持つこと、蛍光顕微鏡で観察されていたフラクタル様凝集体を構成する最小単位である顆粒状凝集体は、より小さい顆粒から成るフラクタル様の形態であることを明らかにした。本研究成果を国際科学雑誌「BMC Biology」に投稿し、受理された。さらに、NAPドメインは植物アルゴノートにも広く保存されていること見出した。本年度は、実際にN末端の凝集を確認したシロイヌナズナアルゴノート１（AtAgo1）のN末端変異シロイヌナズナ個体を作出した。上記変異体を用いて、RNAシーケンシング法によりAtAgo1の遺伝子発現調節活性を評価したところ、凝集能の欠損は全体的な遺伝子発現に大きな影響を及ぼさないことが示唆された。しかしながら、変異個体の表現型を観察したところ、凝集能の欠損は初期の苗において軽微な成長遅延を引き起こし、本表現型は凝集能を保持した変異体において回復した。したがって、NAPドメインの凝集は苗の成長に関与することが示唆された。そこで、本成長遅延を引き起こす分子メカニズムを明らかにするために、凝集能欠損変異体の発現変動遺伝子に着目したところ、核内外ともに野生型AtAgo1の標的ではない遺伝子が検出された。本結果から、AtAgo1のN末端の凝集は一部の小分子RNAの選択性に関与していることが示唆された。
Research Progress Status	令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和4年度が最終年度であるため、記入しない。