グラム陰性細菌の膜タンパク質挿入機構を模倣した人工細胞の創出
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21J12786
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
野場 考策 名古屋大学, 工学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
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| Keywords | リポソーム / ボトムアップ合成生物学 / 人工細菌 / 微生物工学 |
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| Outline of Research at the Start |
β-バレルタンパク質のうち、膜にナノポアを形成するβ-バレルポアは、生体分子を検出するバイオセンサーとしての利用が注目されている。β-バレルポアでの検出範囲拡張には、β-バレルポアの改良が必要である。膜タンパク質の機能進化には、リポソームディスプレイ法による進化工学的手法が使われている。しかし、膜挿入時に生化学的な相互作用を要するβ-バレルポアでは、この手法を用いることがが困難である。
申請者は、β-バレルタンパク質がグラム陰性細菌外膜の主要構成要素であることに着目した。本研究では、β-バレルタンパク質の挿入機構を模倣した人工細胞の創出による、β-バレルポア機能向上の新規手法の提示を目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該の研究課題の達成のために、リポソーム膜の内葉及び外葉にそれぞれ異なるタンパク質を配向した細菌サイズのリポソーム創出を行った。目的達成のため、過去に報告されているリポソーム作成方法である、Oil in water emulsion法とExtruder法の組み合わせに着目した。これによりリポソーム膜内葉にベンジルグアニン基を修飾した脂質及びSNAP-GFPを、外葉にビオチン基を修飾した修飾脂質及びStreptavidin-Alexafluore 647を配向させた。得られたリポソームの粒子径分布を動的光散乱法による粒子径の評価により作成されたリポソームのサイズは直径1 μmであったため、細菌サイズのリポソームが作成できていることを確認した。また、フローサイトメトリーを用いてAlexafluore 647とSNAP-GFP両者の蛍光を評価したところ、膜内外で異なるタンパク質組成を持つ細菌サイズのリポソーム構築に成功したと考えられる。作成したリポソームがユニラメラであることが細菌の機能再現においても重要であるため、クライオ電子顕微鏡およびα-hemolysinを用いたラメラリティ評価を行ったところ、90%を超えるリポソームがユニラメラであることが明らかとなった。この結果は過去のリポソーム作成方法として知られるExtruder法と比較しても非常に高く、本手法で作成したリポソームは細菌の膜機能やその構造を高度に再現できることが示唆された。本研究内容はACS synthetic biologyにてAcceptされており、細菌における膜タンパク質分泌、シグナル伝達、膜分裂に関連する機能再現に資すると考えられる。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)
