| Project/Area Number |
21J12881
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
櫻井 まりあ 東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
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| Keywords | LRRK2 / Rab / リソソーム / 細胞外分泌 / パーキンソン病 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、パーキンソン病(PD)病因キナーゼLRRK2が担うストレス応答性リソソーム内容物細胞外放出機構の全容解明を試みる。これまでの研究により、リソソーム負荷時のLRRK2によるRab GTPaseリン酸化依存的に細胞外放出が生じることが明らかとなったが、その詳細な分子機構は不明である。そこで、これまでに構築したLRRK2依存的な細胞外放出検出系を用いて関与する分子の同定を行い、LRRK2の果たす役割を解明する。また、その放出機構の異常がPD発症へと至る機序を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、パーキンソン病病因遺伝子産物LRRK2のキナーゼ活性に依存するストレス応答性リソソーム分泌のメカニズム解明を目的とする。リソソーム酵素の細胞外放出を検出する実験系として蛍光基質を用いたb-ヘキソサミニダーゼ活性測定系を確立した。この実験系を用いることにより従来用いてきたウエスタンブロットよりも簡便かつ高感度にリソソーム分泌を評価することができた。この実験系を用い、薬理活性が既知の化合物を対象としたスクリーニングを実施した。化合物は東京大学創薬機構に供与されたValidated Compound Libraryを使用した。培養細胞に対してリソソーム指向性薬剤であるクロロキン(CQ)を添加することでリソソームストレスが生じた際の培地中b-ヘキソサミニダーゼ活性を測定し、十分な活性阻害効果を発揮する化合物の同定を試みた。また、化合物が直接酵素活性を阻害する可能性やリソソームpHに与える影響についても検討を行い、最終的に3910化合物から15化合物についてCQ処理にともなうリソソーム分泌の阻害剤として同定した。これらの化合物についてin vitro kinaseアッセイによるLRRK2キナーゼ活性への影響を評価したところ、いずれもキナーゼ活性の抑制効果は認められなかった。また、これまでに明らかにしたLRRK2の活性評価指標であるCQ処理時のLRRK2のリソソーム局在化、リソソーム肥大化、基質Rab10リン酸化について評価を行ったがそれぞれの化合物において異なる挙動を示した。同定した15化合物はいずれも細胞外放出やリソソーム機能への関与が報告されておらず、既知化合物の新たな薬理作用を見出した可能性がある。また、LRRK2の既知薬理機構への関与も報告されていないため、これらの化合物による放出阻害機構の解明がLRRK2によって制御される新規リソソーム分泌経路の同定につながると考えられる。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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