| Project/Area Number |
21J12999
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
石坂 優人 北海道大学, 生命科学院, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
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| Keywords | 運搬リボ核酸（tRNA） / 鉄硫黄クラスター / tRNA硫黄修飾 / 2-チオウリジン合成酵素 / X線結晶構造解析 / 反応機構解析 / 構造生物学 / 生物物理学 / 酸化還元生物学 |
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| Outline of Research at the Start |
tRNAが蛋白質合成を担うためには、硫黄修飾などの成熟化が必要である。ヒト硫黄修飾の異常は、がん・II型糖尿病・神経変性疾患・ミトコンドリア病にも関与する。2-チオウリジン合成酵素TtuAの酵素活性には酸化に脆弱な鉄硫黄クラスター[4Fe-4S]が必要であり、硫黄ドナー蛋白質TtuBと共にtRNA54位のウリジンの酸素を硫黄に置換する。一方、TtuAファミリーに属すNcs6には、硫黄ドナー蛋白質と結合できない鉄硫黄クラスター[3Fe-4S]を持つという報告もある。そこで本研究は、TtuA-tRNA複合体の構造機能解析により、鉄硫黄クラスターを持つtRNA硫黄修飾酵素の詳細な反応機構を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は昨年度、2-チオウリジン合成酵素TtuAに結合した鉄硫黄クラスター構造とTtuAの酵素活性を経時的に相関解析し、活性型TtuAは[4Fe-4S]鉄硫黄クラスターのみ持つことを明らかにした。今年度は、これらの結果を査読あり国際誌International Journal of Molecular Sciences誌に発表するとともに、TtuAのtRNA活性化機構（アデニル化tRNA合成機構）の解明を目指した。
TtuA-tRNA複合体の精製は困難だったため、TtuAの結晶に基質塩基5-メチルウリジン（m5s2U）またはUMP、さらにATPをソーキングし、X線結晶構造解析に取り組んだ。その結果、分解能2.5 Å程度で[4Fe-4S]-TtuAとATPまたはADPとの複合体の電子密度を得た。これらの構造は、TtuAがATPをADPに加水分解し、tRNA活性化に利用する可能性を示唆している。一方で、ATPを利用した時のTtuAの酵素活性（m5s2U合成活性）に比べ、ADPを利用した時の酵素活性は約3割しかなかった。したがって、tRNA活性化にATPが直接使われるか、ADPが使われるかを明らかにするためには、さらなる研究が必要である。
次に我々は、TtuAと基質塩基との相互作用様式を明らかにするために、tRNAリシジン合成酵素TilS-tRNA複合体の構造に基づき、TtuA-m5s2U-ATP複合体のモデル構造を構築した。さらに、このモデル構造に基づいて8種類の変異体を作成し、HPLCでTtuAの酵素活性を解析した。その結果、R138A変異体の酵素活性が完全に消失した。我々のモデル構造では、Arg138はm5s2Uのリン酸基と相互作用しており、TtuAファミリー内で完全に保存されている。したがって我々は、Arg138がTtuA-tRNA複合体形成に必須であると結論付けた。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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