| Project/Area Number |
21J13113
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
釜阪 紘平 京都大学, 化学研究所, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2021-04-28 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000)
Fiscal Year 2022: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000)
Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
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| Keywords | 細胞外膜小胞 / 分泌タンパク質 / X線結晶構造解析 / ゼータ電位 / タンパク質輸送 / タンパク質分泌装置 / 莢膜多糖 |
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| Outline of Research at the Start |
普遍的に細菌は細胞表層より膜小胞を生産することが知られ、この膜小胞に特定のタンパク質を提示することで、酵素を集積した機能性ナノ粒子、抗原を提示したワクチン、膜環境中で機能する膜タンパク質などの分泌生産系などの開発基盤として応用できる。しかし、従来の細菌では膜小胞の生産量の低さや、夾雑タンパク質が多いことが問題であった。そこで、本研究では、高純度にタンパク質を内包した膜小胞を細胞外に高分泌する新奇細菌を用い、そのタンパク質の膜小胞への輸送機構を解明し、得られた知見に基づいて、膜小胞による新奇タンパク質生産系の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Shewanella vesiculosa HM13 は 約 49 kDa のタンパク質 P49 を主要な積荷とする細胞外膜小胞 (EMV) を生産する。P49 はEMV による新奇タンパク質生産系の開発のためのキャリアとして期待されている。前年度までの研究によって、P49 は II 型輸送装置様分泌装置の働きによって細胞内から汲み出され、その後 Wzx 依存的に合成される EMV の莢膜多糖成分と相互作用することで EMV へと輸送されることが分かった。しかし、依然として生理機能、構造など基本的な情報が不足していることと、融合タンパク質の生産系の構築が難航していることが課題であった。
P49 の C末端領域へ変異を導入する試みによって、C 末領域は P49 の EMV 中での発現に重要であることが判明したが、タグや異種タンパク質の導入に適した部位の特定には至っていない。このためには、X 線結晶構造解析による構造情報の取得が重要である。そこで、 P49 の結晶化条件のスクリーニングを実施した。結果、精製 P49 を再現性良く結晶化する条件を発見するに至った。現在、本結晶を用いて、重原子置換法による位相決定が進行中である。
同時に、P49 の生理機能についても解析を進めた。結果、P49 は EMV のゼータ電位の絶対値を上昇させ、EMV 同士の静電的な反発が強め、EMV の分散性を向上させる機能を持つことが分かった。この分散性の上昇によって、EMV の表面積が増加し、EMV と細菌細胞との相互作用が促進されると考えられた。
本研究によって、P49 の EMV への輸送機構や生理機能が明らかとなり、構造解析への道も拓かれた。融合タンパク質の発現やP49 へのタグ導入に関しては現状難航しているものの、今後の発展の基礎になる成果が得られたと考える。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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