人工脂質膜を反応場とした難溶性膜タンパク質完全化学合成法の開発研究

Research Project

Project/Area Number	21J14744
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Single-year Grants
Section	国内
Review Section	Basic Section 47010:Pharmaceutical chemistry and drug development sciences-related
Research Institution	The University of Tokushima
Principal Investigator	大川内健人徳島大学, 大学院薬科学教育部, 特別研究員(DC2)
Project Period (FY)	2021-04-28 – 2023-03-31
Project Status	Completed (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2022: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000) Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Keywords	膜タンパク質 / ネイティブケミカルライゲーション / 人工脂質膜 / 脂質ナノディスク / Native Chemical Ligation
Outline of Research at the Start	生命現象の理解に繋がる膜タンパク質研究において、その機能解明に資する分子ツールとして非天然構造導入人工膜タンパク質が注目されている。これら分子ツール調製には膜タンパク質の化学合成が不可欠であるが、未だ実用的な合成法論の確立には至っていない。これはタンパク質合成で汎用される水系溶媒に対して、膜タンパク質を構成するペプチドフラグメントが難溶なためである。本研究では水溶性人工脂質膜を利用した膜ペプチドフラグメントの可溶化戦略により、新規膜タンパク質化学合成法論の確立を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、脂質ナノディスクを反応場とする膜タンパク質化学合成に向けた基盤技術の確立を目的としている。生体内機能解析に向けた分子多様性拡大の観点からも、膜タンパク質化学合成は達成すべき課題であるが、膜タンパク質を構成するペプチドフラグメントの水系溶媒への難溶性が化学合成を阻んでいる。すなわち、膜貫通フラグメントが水系溶媒に溶解せず、タンパク質化学合成に不可欠のNative Chemical Ligation (NCL) 法による縮合及びその連続化が不可能である点が克服すべき課題である。前年度までに申請者は、脂質ナノディスク導入型膜貫通フラグメントと細胞内および細胞外フラグメントを用いた連続的NCL反応により、一回膜貫通タンパク質であるインフルエンザM2タンパク質の化学合成に成功している。そこで今年度は、本手法を発展させ、複数回膜貫通タンパク質化学合成に向けた検討を行った。申請書で示した、脂質ナノディスク間でのNCLを行う戦略では複数回膜貫通タンパク質の合成は達成できなかった。そこでM2タンパク質合成時に得られた、pH依存的な脂質ナノディスク崩壊に伴う脂質―ペプチド複合体への変換現象を利用する戦略を立てた。脂質ナノディスク崩壊条件等について種々検討を行ったところ、NCLに用いるチオール触媒存在下酸性条件にて膜貫通フラグメント導入型脂質ナノディスクの崩壊とともに脂質―ペプチド複合体に変換され、複合体中でNCLが進行することを明らかにした。さらに、本現象を用いることでモデル検討ながら二回膜貫通タンパク質の合成に成功した。
Research Progress Status	令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
Strategy for Future Research Activity	令和4年度が最終年度であるため、記入しない。