オンサイトで迅速に利用可能な核酸抽出不要の微生物解析技術の開発
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21K04328
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 22060:Environmental systems for civil engineering-related
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| Research Institution | Nagaoka National College of Technology |
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Principal Investigator |
川上 周司 長岡工業高等専門学校, 環境都市工学科, 准教授 (00610461)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 細菌定量 / aptamer / real-time PCR / シングルセル解析 / アプタマー / 深層学習 / 環境微生物 / 遺伝子工学的手法 / 排水処理工学 |
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| Outline of Research at the Start |
排水処理工学の分野においても様々な水質センサーが開発され、瞬時にシステム内の水質 状況が把握できるようになってきた。こうした背景の中、システムの AI 化や IoT 化の流れは 加速しており、微生物情報を迅速に得るための微生物センサーの開発も望まれる。しかし、 微生物解析手法の多くは核酸抽出を必要とする遺伝子工学的手法であり、結果を得るのに最 低でも一日はかかることから有用な微生物センサーは今のところない。本研究では、この 「核酸抽出の壁」を越えるべく、細胞壁の外側で微生物同定が可能な DNA アプタマーとこれまでの既存の遺伝子工学的手法を組み合わせた新規の微生物解析手法を開発する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
水環境中の細菌群において、その存在数をモニタリングする方法としてはrRNA遺伝子やtuf遺伝子の遺伝子数を定量するreal-time PCR法がある。しかしながら遺伝子定量を行うためには細菌の細胞からDNAを取り出す必要があり、さまざまな種類の細胞構造から普遍的にDNAを抽出することが難しいことから、その測定結果には抽出効率によるバイアスを含むことになる。本研究ではDNA aptamerとreal-time PCR法を組み合わせることでDNA抽出を介さずに試料中の任意の細菌数を定量できないかと考えた。本研究では、初期検討として、段階希釈で作成した存在数の異なる細菌サンプルを作成し、それらに結合したaptamerの数をreal-time PCRで計測することで開発を目指す技術の実現可能性を検討した。
段階希釈したE.coliに対しP12-55 aptamerを結合させ、熱変性によって剥がしたaptamerの数をreal-time PCRで計測した。結果、すべてのサンプルからaptamerの検出に成功した。ただ、初期菌体量とPCR増幅の立ち上がりにおけるサイクル数 (Ct値) の両者間には、通常の遺伝子定量時における検量線サンプルで見られるような均等な間隔での立ち上がりにはならなかった。これは細菌の段階希釈において細胞固定を行わなかったことが原因であると思われ、実験過程の中でも細菌の増殖が見られたことなどが要因と考えられる。それでも10^8 cell/mLが最も増幅曲線の立ち上がりが早く、段階希釈に応じてその立ち上がりは遅くなっていく傾向が見えた。このことから、初期菌体量とaptamerの量には相関がみられ、細菌数を定量できる可能性を示すものと判断した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
aptamerとreal-timePCR法を組み合わせた定量系を構築するなど、研究は当初の計画通りに進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は複数種の細菌を混合した系や、平板培養法との定量結果の比較などの検討を行う予定である。
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Report
(2 results)
Research Products
(1 results)
