Factors involved in difficult-to-express protein production and their characterization
| Project/Area Number |
21K04795
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
河原崎 泰昌 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (80303585)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 瑞己 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 准教授 (70803344)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
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| Keywords | 組換え蛋白質 / 出芽酵母 / 分泌蛋白質 / 転写因子 / 発酵 / 難生産性蛋白質 / プロモーター / 出芽酵母発現系 / 難生産性組換え蛋白質 / 酵母異種蛋白質発現系 / 機能未知転写因子 / レアコドン / 組換え蛋白質分泌生産 / 遺伝子工学 / 遺伝子発現制御 / 酵素 / 遺伝子発現 / 蛋白質生産 / 進化工学 |
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| Outline of Research at the Start |
次世代シーケンサーの普及により、利用可能な遺伝子・cDNAの配列情報は急速に拡大している。その一方、遺伝子産物である蛋白質や酵素の調製・解析は、依然として組換え発現系の構築・最適化が必要であり、試行錯誤的である。さらに、すべての遺伝子が組換え生物で活性型発現するわけではなく、発現に伴い宿主に毒性を示す蛋白質・酵素も多い。
本研究は、種々の組換え蛋白質および宿主を用いて蛋白質折りたたみに関する基礎情報を収集し、折りたたまれやすい蛋白質
の配列の予測を試みる研究である。同時に、細胞毒性を示すために低収量となる蛋白質・酵素の生産に適した、新たなプロモーターを用いた組換え蛋白質生産システムを構築する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
発現による宿主細胞への毒性や不十分な折りたたみに起因する「難生産性組換え蛋白質」の発現系を構築し、難生産性の効率的回避手段を提案するのが本研究の目的である。これまでに「組換え酵母細胞を高密度に懸濁し、発現誘導を行う」という簡便な操作により生産量が高まる現象を見出した。
本研究では、高密度発現系において発現量が増大する宿主遺伝子であるYgr067C遺伝子に着目した。同遺伝子は機能未知の転写因子をコードしており、自身の発現を負に調節した。その後の解析により、培地中の糖濃度の低下に応答して同遺伝子の発現量が増加し、多くのミトコンドリア蛋白質をコードする遺伝子の発現を調節すること、無酸素条件下で細胞をG1期で停止させること、発現した転写因子は細胞周期に依存して急速に分解されることなどを明らかにし、これらを介して発酵終了後の酵母細胞の休眠状態を安定化することを見出した。同遺伝子欠損株は、無酸素条件下における細胞周期の停止が明確ではなく、定常期における蛋白質合成速度が増大していた。同遺伝子のプロモーター領域を目的蛋白質遺伝子に連結し、同遺伝子欠損株にて発現させたところ、培養後期に著量の蛋白質を生産することが可能となった。
他方、出芽酵母で発現毒性を示す分泌蛋白質である糸状菌β-ガラクトシダーゼ（lacA蛋白質）をモデル蛋白質として、同酵素の活性型発現が生育にとって必須となる培地条件（ラクトースのみを炭素源とする低栄養合成培地）を用い、プロモーターの最適化を行った。具体的には、lacA遺伝子上流域に酵母染色体DNAの限定加水分解断片をクローン化してライブラリーを作製し、平板寒天培地上で繰り返し良好生育株を選別した。選択されたプロモーター配列の性質決定を行ったところ、恒常的に弱い遺伝子発現を引き起こすDNA断片が最適プロモーターとして選択されたことがわかった。
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Report
(3 results)
Research Products
(10 results)
