エクソソーム内封マイクロRNA解析マイクロデバイスの開発
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21K04851
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 28040:Nanobioscience-related
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
津金 麻実子 中央大学, 理工学部, 共同研究員 (00469991)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
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| Keywords | リポソーム / エクソソーム / マイクロ流体デバイス / マイクロデバイス |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、人工脂質膜小胞であるジャイアントリポソームを検出反応の容器（リアクター）として用い、エクソソーム内封miRNAを高感度および簡便に検出可能なマイクロデバイスを構築する。具体的には、エクソソームを含む数十マイクロリットルのサンプル（培養上清または体液）に対し、マイクロピラーや磁気ビーズを用いたエクソソームの回収と精製、反応試薬内封リポソームとの膜融合によるmiRNAサンプルの取得、miRNAの増幅反応、蛍光検出の一連の操作を実行するマイクロデバイスの開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、人工脂質膜小胞（ジャイアントリポソーム）を検出反応の容器であるバイオリアクターとして用いて、エクソソームに内封されたマイクロRNAを検出するマイクロデバイスの構築を目的としている。このデバイスは回収エリア、移送エリア、反応・検出エリアの3つのエリアから構成され、エクソソームの回収と精製、miRNAの取得と増幅、検出の操作を1つのチップ上で実行する簡易型プロトタイプデバイスの開発を目指す。
2年目である本年度は、反応・検出エリアとなるマイクロデバイス内でのリポソームとヒト由来エクソソームの電気融合、標的マイクロRNAの増幅反応と蛍光検出を1年目に開発したデバイスを用いて検討した。リン脂質を用いて界面通過法により作製したマイクロRNA増幅試薬内封リポソームとヒト由来エクソソームをデバイスに導入し、電圧印加によりリポソームとエクソソームを電気融合させた。その後、リポソーム内でマイクロRNAの等温増幅を実行し、増幅産物の蛍光検出を行った。
また、本年度は回収エリアの開発にも取り組んだ。サンプルからのエクソソーム回収は、膜にホスファチジルセリンを有するエクソソームとホスファチジルセリン結合分子を固相化した磁気ビーズとのアフィニティー結合により行う。極微量のサンプルを効率的に混合するため、マイクロピラーを有する基板に微小旋回振動を与えることでピラー周囲に振動誘起流れを生じさせて溶液を混合するマイクロ混合デバイスを用いた。本デバイスでエクソソームとアフィニティービーズを混合することにより、エクソソームとビーズの結合に由来するビーズの凝集が確認され、エクソソーム回収におけるマイクロ混合デバイスの有用性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度は、エクソソーム模擬リポソームとリアクターとしてのリポソームを用いて、膜小胞の電気融合によるマイクロRNAと増幅反応試薬の混合と、標的マイクロRNAの増幅・検出を連続して実行するデバイスを開発した。本年度は、実際にヒト由来エクソソームを用いても一連の操作が可能か検討した。リポソーム膜とエクソソーム膜の融合の可否は、蛍光標識したエクソソーム膜が膜融合によりリポソーム膜上に広がることで確認できた。さらに、電気融合とそれに続く増幅反応後のリポソームの一部でマイクロRNAの増幅反応による蛍光プローブの蛍光強度の上昇が検出された。しかし、融合効率が低く、蛍光強度の変化が微弱であることから、さらなる条件検討が必要である。
加えて本年度では、本研究室で開発中のマイクロ混合デバイスのエクソソーム回収への応用を試みた。このデバイスでは振動を付与したマイクロピラー（微小な柱）の周囲に誘起される流れ（振動誘起流れ）により溶液を混合する。エクソソーム標準品とホスファチジルセリン結合分子を固相化した磁気ビーズをピエゾステージ上に設置したデバイスに極微量（10 マイクロリットル以下）導入し、旋回振動を付与して溶液を混合し、磁気ビーズへのエクソソームの結合を促した。その結果、数十分の混合でもエクソソームとビーズの結合に由来するビーズの凝集が確認された。
このように、本研究課題で構築を目指すマイクロデバイスの各エリア（要素技術）における実験条件が着実に確立されつつあり、研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、回収エリアから夾雑物の混入を最小限にしてエクソソーム結合磁気ビーズのみを反応・検出エリアに移送する移送エリアの開発に着手する。本エリアでは、基板表面の親水・疎水加工のパターンにより水滴をトラップする技術を応用し、回収エリアに含まれるビーズだけを溶液中から抽出するデバイスの作製を試みる。
回収エリアのデバイスでは、直径がナノメートルオーダーのエクソソームを直径約1マイクロメートルの磁気ビーズに効率的に結合させるマイクロピラーのサイズや形状、振動周波数などの最適な条件を見出すことを目指す。
反応・検出エリアのデバイスでは、エクソソームと反応試薬内封リポソームとの高効率な電気融合条件の確立に向けて、電極の配置や距離、電気パルスの印加条件やリポソームの脂質組成などを詳細に検討する。さらに、磁気ビーズに結合したエクソソームとリポソームの電気融合をデバイス上で試みる。
各エリアにおける技術が確立したら、回収、移送、反応・検出の一連の操作を実行可能な統合デバイスの試作やシステムの動作検証を目指す。
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Report
(2 results)
Research Products
(19 results)
