細胞表層を反応場としたタンパク質間相互作用解析系の構築
| Project/Area Number |
21K05130
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 34020:Analytical chemistry-related
|
|---|
| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
末田 慎二 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (00325581)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
|
|---|
| Keywords | タンパク質相互作用解析 / 蛍光イメージング / 培養細胞 / 平衡結合解析 / タンパク質間相互作用解析 / タンパク質間相互作用 / 相互作用解析 / 細胞表層 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
本研究では、培養細胞の表層を反応場として利用したタンパク質間相互作用解析系の構築を行う。具体的にはターゲットとなる標的タンパク質を、膜タンパク質を介して培養細胞の表層に発現させ、そこに蛍光ラベル化したもう一方のタンパク質を添加して、両者の相互作用を蛍光イメージングにより解析する。本解析系では反応場となる細胞が自ら標的タンパク質を産生し、その表層に提示するという特徴を有しており、原理的に様々なタンパク質間相互作用を対象として解析することが可能である。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、培養細胞の表層を反応場として利用したタンパク質間相互作用解析系を開発することを目的として研究を実施した。具体的にはターゲットとなる標的タンパク質を、膜タンパク質を介して培養細胞の表層に発現させ、そこに蛍光ラベル化したもう一方のタンパク質を添加して、両者の相互作用を蛍光イメージングにより解析する系の構築を目指し研究を進めた。
まずタンパク質間相互作用のモデル系として、ビオチンリガーゼ（BPL）とその基質タンパク質（BCCP）を利用して相互作用解析系の構築を行った。ここでは、BCCPを膜タンパク質（TM）との融合タンパク質として細胞表層上に発現させた。その融合タンパク質を発現させた細胞に対して、フルオレセインでラベル化したBPLを添加して相互作用解析を実施した。その結果、BPLとBCCP間のアフィニティーデータを比較的高い精度で取得することに成功した。
次にタンパク質間相互作用のモデル系として、Rapamycinによって結合が促進されることがよく知られている、FKBP12とFRB間の相互作用を利用して解析系の構築を行った。ここでは FKBP12 を細胞表層に提示し、GFPでラベル化したFRB（GFP-FRB）を添加して評価を行った。その結果、Rapamycin共存下でのみ細胞表層からGFPに由来する蛍光が観察され、この系を利用してFKBP12とFRB間の特異的な結合をモニターできることがわかった。しかしながらGFP-FRBのディッシュ上への非特異的な結合やGFPに由来する蛍光の自己吸収が問題となり精度の高いアフィニティーデータを取得することができなかった。そこでGFPの代わりにフルオレセインでラベル化したFRBを調製し検討を行った。その結果、相互作用解析の精度を向上させることができることを示すデータを取得することができた。
|
Report
(3 results)
Research Products
(8 results)
