Structural analysis of L-amino acid oxidases with strict substrate specificity
| Project/Area Number |
21K05278
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
稲垣 賢二 岡山大学, 環境生命自然科学学域, 特任教授 (80184711)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今田 勝巳 大阪大学, 大学院理学研究科, 教授 (40346143)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | L-リジン酸化酵素 / L-グルタミン酸酸化酵素 / 基質認識機構 / 酵素の成熟化 / X線結晶構造解析 / L-リシン酸化酵素 / 成熟化機構 / 飽和変異 / L-glutamate oxidase / L-lysine oxidase / processing / substrate specificity / biosensor |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では， 高基質特異性のL-アミノ酸酸化酵素に焦点を当て， 遺伝子工学, 進化工学等の生物工学的手法を駆使して， そのユニークな成熟化機構と基質認識機構を明らかにすることを目的とする。数多くの存在が知られているL-アミノ酸酸化酵素の中で際立って厳格な基質特異性を示す放線菌由来のL-グルタミン酸酸化酵素と糸状菌由来のL-リシン酸化酵素という極めてユニークな性質を持つ微生物酵素に焦点を当て， 厳格な基質特異性を示す要因とプロッセシングによる活性化， 安定化の機構を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では，高基質特異性L-アミノ酸酸化酵素である放線菌由来のL-グルタミン酸酸化酵素(LGOX)および糸状菌由来のL-リシン酸化酵素（LysOX）の基質認識機構とプロセシングによる活性化・安定化機構を明らかにし，特定アミノ酸のみを基質とする酵素や，逆に全てのアミノ酸に作用する酵素といった新規酵素群の創出を目的としている．2022年度までにLysOXの基質認識機構と活性化・安定化機構，LGOXの基質認識機構を解明した．2023年度は，LGOXのプロセシングによる活性化・安定化機構を解明するため，LGOX前駆体のX線結晶構造解析に取り組み，2.76A分解能で解析に成功した． 当初MBP融合蛋白質として大腸菌で発現・精製したところ，4量体と2量体が得られ，それぞれ結晶化した．しかし，分解能が4A程度の結晶しか得られなかった．そこで，タグの変更等を行い精製法の改良を行なったところ，N末にHis-tagを付加して発現し，さらにリシン残基のメチル化して精製した試料について4量体のみが得られ，これを結晶化したところ3A分解能を超える結晶が得られた．得られた結晶はtwinであったがソフト的に分離することで，最終的に2.76A分解能の構造が得られた．この構造をプロセシング後の構造と比較したところ，プロセシングにより２本のヘリックスが移動することで基質主鎖カルボキシ基と直接相互作用するY562と基質側鎖と相互作用するW564の位置が基質との相互作用に適した位置に移動していた．すなわち，LGOXは基質の入口を物理的に塞ぐのではなく，基質結合部位の構造を小さく変化させることで成熟化後の活性を増大させていることがわかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
長年未解明であったLGOX前駆体の構造解析に成功し，既知の成熟型酵素との構造比較を行うことができた．その結果，LGOXの成熟化機構の一端を明らかにした．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに得られている活性部位付近の残基の置換によりTyrに対する基質特異性を獲得したLGOX E617変異体の構造解析および構造に基づく活性部位付近の残基に複数の変異を導入することでさらに基質特異性の異なる酵素の作成を実施する．
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Report
(3 results)
Research Products
(29 results)
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[Journal Article] Evolution and properties of alanine racemase from Synechocystis sp. PCC6803.2021
Author(s)
Ashida, H., Murakami, K., Inagaki, K., Sawa, Y., Hemmi, H., Iwasaki, Y. Yoshimura, T.
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Journal Title
Journal of Biochemistry
Volume: mvab155
Issue: 4
Pages: 421-428
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Open Access
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