| Project/Area Number |
21K05301
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 37020:Chemistry and chemical methodology of biomolecules-related
|
|---|
| Research Institution | Kobe University |
|---|
Principal Investigator |
日高 興士 神戸大学, 研究基盤センター, 特命技術員 (30445960)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安達 基泰 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 量子生命科学研究所, 上席研究員 (60293958)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
|
| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
|
| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
|
|---|
| Keywords | 酵素活性 / 阻害剤 / ストレプトアビジン / ビオチン / プロテアーゼ / SARS-CoV / Mpro / PLpro / 新型コロナウイルス / 検査法 |
|---|
| Outline of Research at the Start |
本研究課題ではX線構造情報を活用してSARS-CoV-2のMpro阻害剤およびPLpro阻害剤のビオチン化部位を決定してビオチン誘導体を合成し、ストレプトアビジンの添加による親和性競合の評価を行う。そして、唾液や血液成分に混入したモデル検体からSARS-CoV-2プロテアーゼを取り出して親和性競合により酵素活性が検出できることを明らかにする。さらに、ビオチン-ストレプトアビジンとは別の強い親和性競合を探索して酵素活性検出の改善を図り、SARS-CoV-2の迅速で簡便な画期的な検査薬の開発につなげる。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、感染細胞に由来する新型コロナウイルスの2種のプロテアーゼを標的にリムーバブル阻害剤を各種合成し、モデル検体から親和性競合による酵素活性の検出を行い、感染細胞の有無の判定につながる画期的な検査薬の開発に向けて新型コロナウイルスの正確で簡便な新規検出法の確立をめざす。
R3年度にMproおよびPLproに関して大腸菌での発現を試みた結果、SDS-PAGE分析により、ともに大腸菌抽出液の可溶性画分に発現タンパク質と思われるバンドが検出された。特に、PLproに関しては最も主要なバンドとして検出され大量発現に成功した。
R4年度の取り組みにおいては、Mproの可溶性画分での発現量の増大を目的とし、すでに報告されているMproの立体構造を参考にアミノ酸側鎖が分子表面に存在する疎水性アミノ酸のうちから、比較的溶媒への露出が高く酵素の触媒部位に影響を与えないと考えられる部位を選択した。3種の変異体I59R、F223E、F223E/L232Rの発現プラスミドを作製したのちに大腸菌発現を試みたところ、SDS-PAGEでは発現量の顕著な増大は認められなかった。
R5年度はビオチン化Mpro阻害剤について、公開されたPF-07321332の合成経路を基にニルマトレルビルおよびリムーバブル阻害剤の合成を実施した。PLproについては既知の可逆的阻害剤から結合を妨げない部位にビオチンを繋いだ誘導体を設計した。精製した野生型Mproについてニルマトレルビルとの共結晶構造解析を試みた。しかし、R4年度末の職場火災の影響により研究環境が復旧するまでに想定外の時間がかかったため、実施計画どおりには研究は進まなかった。
|
