大腸菌の新規 yafD-yafE TA system の機能同定

• Project/Area Number: 21K05347
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38020:Applied microbiology-related
• Research Institution: Osaka Metropolitan University (2022); Osaka City University (2021)
• Principal Investigator: 山口 良弘 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (00737009)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2021: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: γ-グルタミルアミントランスシクロラーぜ / アミノ酸合成 / 大腸菌 / Toxin-antitoxin system / RNA polymerase / suppresor mutant / toxin-antitoxin system / パーシスター

Outline of Research at the Start

Toxin- antitoxin (TA) system は、原核生物において自殺遺伝子 (toxin) を制御するシステムで、 ストレス環境下での生存に重要なことが示唆されている。しかし、その作用機構及び生理的 役割は未だ不明である。同定した YafD-YafE TA system の、(1) YafD toxin の標的同定、(2) YafD の標的に対する作用機構、(3) YafE antitoxin による YafD 毒性中和機構、および (4) yafD-yafE 欠損株を作成して生理的役割 を解明し、TA system の役割の一端を明らかにすることを目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

新規 TA system として YafD-YafE を同定し、YafD toxin はRNA ポリメラーゼ活性を阻害することが示唆されている。本研究では、(1) YafD toxin の標的を同定、(2) YafD の標的に対する作用機構、(3) YafE antitoxin によるYafD 毒性中和機構、及び (4) yafD-yafEの生理的役割の解明を目的として実験を行っている。昨年度はYafDタンパク質の可溶化およびyafD 遺伝子のsuppressor gene の取得を試みた。
今年度は、suppressor gene の探索の結果得られた2つの大腸菌のゲノム DNA 領域から、suppressor gene の同定を試みた。その結果、ytfP 遺伝子の共発現は YafD による生育阻害を抑制することが示された。一方で、これまでの実験から YafDは RNA 合成を阻害することが示された。今回取得した DNA 領域には RNA ポリメラーゼのオメガ因子である rpoZ が含まれていており、YafD はRpoZ と拮抗阻害して RNA ポリメラーゼと結合することで大腸菌の生育を阻害する可能性が考えられたが、rpoZ 遺伝子は YafD による生育阻害に影響しなかった。YtfP は γ-glutamylamine cyclotransferase family に属する機能未知タンパク質であるため、YafD はアミノ酸合成を阻害していると考えられた。そこで、アミノ酸添加および無添加の M9 合成培地における YafD による生育阻害を解析した結果、アミノ酸の添加は YafD の生育阻害作用を抑制した。よって YafD はアミノ酸合成を阻害していると考えられた。
YafD の可溶化タグとして GST、MBPを用いたが、すべて不溶化タンパク質として発現された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

昨年度に引き続き、YafD toxin タンパク質を可溶化タンパク質として取得するためにいくつかの可溶化タグを用いて実験を行なったが、全ての融合タンパク質は不溶化タンパク質として発現された。発現誘導のタイミングおよび温度などの条件も変更させたが、これまで可溶化タンパク質として発現出来る条件を見つけることができずにいる。そのため、in vitro で計画していた全ての実験を計画通り遂行できていない。
一方で、suppressor geneの探索では、YafD の毒性を中和する遺伝子として YtfP を見出した。当初、YafD が RNA polymeraseを標的としていると考えており、RNA polymeraseの構成成分が同定されると考えていたが、見出した遺伝子はアミノ酸合成に関与すると考えられる遺伝子であった。この結果から、YafD はRNA polymeraseではなくアミノ酸合成を阻害し、その結果としてRNA polymerase活性が阻害されていると考えられた。この結果をもとに計画を変更し、実験を行なって行くため評価をやや遅れているとした。

Strategy for Future Research Activity

来年度以降は、YtfPによる YafD の生育阻害中和機構を解明することで、YafD の作用機構を明らかにしていく。培地にアミノ酸（カザミノ酸)を添加すると YafD の生育阻害が中和されることを見出した。そこで、アミノ酸をいくつかのグループに分けて培地に添加し、YafD 誘導下での生育を解析することで、どのアミノ酸が YafD による生育阻害に関与するかを解析する。得られた実験結果から、YtfP に機能を推測するとともに、YafD の作用標的を推測する。また、YafD が YtfP と直接相互作用しているか調べるため、プルダウンアッセイを行う。YafD は可溶化タンパク質として取得できていないが、複合体としてなら可溶化タンパク質として取得できるのではないかと考えている。
YafD の可溶化条件も引き続き探索する。必要な場合は変性剤を用いて denature-renature を行うことで YafD 精製標品を取得し、in vitro での解析を可能にしたい。
また、昨年度は実施できなかったが、ストレス環境下における YafDE TA system の役割を解析するために、yafDyafE 欠損株を作成し、熱ストレスとして 60 度での熱処理、酸化ストレスとして過酸化 水素処理、エタノール添加後の生育、形態変化、および生菌数を測定する。同じ実験を野生株でも行い、yafDyafE TA system の役割を探索する。