パラベンを輸送するペプチドABCトランスポーターホモログの構造と機能柔軟性の解析
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21K05351
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture |
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Principal Investigator |
矢嶋 俊介 東京農業大学, 生命科学部, 教授 (90301548)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | 基質特異性 / Ｘ線結晶構造解析 / 放線菌 / X線結晶構造解析 / 基質 / ABCトランスポーター / ヒドラジド / Actinobacteria門 |
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| Outline of Research at the Start |
非天然化合物であるhydrazide化合物を唯一の炭素源として資化できるMicrobacterium hydrocarbonoxydansから、その代謝を制御するオペロンを見出した。その特徴は、amidase superfamilyに属するhydrazidaseと、既知および新規構造の可能性をもつ２種のABCトランスポーターである。このオペロンは本菌のみならずActinobacteria門に見られること、細菌の生理機能に重要な役割を担っていると考えられる。そこで本申請では、２種のトランスポーターの立体構造、機能解析を中心に、このオペロン構造の生理機能上の重要性解明を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
非天然のヒドラジド化合物を唯一の炭素源として生育可能なMicrobacterium hydrocarbonoxydansにおいてhydrazidaseとABCトランスポーターを含むオペロンが重要な役割を果たしている。
昨年度に引き続き、トランスポーターの大腸菌での発現、in vitroでの発現系構築を試みたが、発現量が非常に低く、かつ、断片化されている可能性が観察され、現在に至るまで解析用の蛋白質量を得るに至っていない。
トランスポーターの発現系構築と並行して、hydrazidaseの天然の基質がパラベンであるという前提のもと、さらなる検証を行った。メチル、プロピル、ブチルパラベンの3つの基質を用いて、hydrazidaseのkinetics解析を行い、kcat, Kmの値からこれらが酵素基質となることが示された。
Hydrazidaseはamidaseファミリー酵素であるが、4-hydroxyphenyl構造が基質特異性を決める構造であることが結晶解析から明らかとなっている。このhydrazidase、ABCトランスポーターを含め、相同なオペロンをもつ放線菌をデータベースより見出している。そのうちの一つPseudonocardia acaciaeからamidase(PaAm)をクローニングし、メチル、プロピル、ブチルパラベンを用いてkinetics解析を行った。kcat, Km値をhydrazidaseと比較すると、パラベンへの指向とHBPHへの指向に差が見られた。昨年度、PaAmの構造解析に成功していたものの、引き続き3 Aからの分解能改善を試みたが、果たせなかった。HydrazidaseとPaAmの立体構造を比較したところ、活性部位入口に位置するループ構造部位に差があり、これがパラベンとHBPHへの基質の指向性に影響を与えていると考えられた。
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Report
(3 results)
Research Products
(2 results)
