Exploration and biochemical characterization of novel regulatory mechanisms of bacterial glutamate dehydrogenases

• Project/Area Number: 21K05358
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38020:Applied microbiology-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 富田 武郎 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任准教授 (50447364)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: グルタミン酸脱水素酵素 / 活性調節機構 / 環境応答 / 炭素・窒素代謝調節 / 立体構造解析 / 好熱菌 / 分裂酵母

Outline of Research at the Start

地球上の多くの生物の炭素・窒素代謝において、グルタミン酸脱水素酵素GDHがその恒常性や環境応答に重要な役割を果たしていることが古くから知られている。しかし、動物のGDHの調節機構が詳細に研究されている一方、微生物等のGDHの調節機構に関してはそのほとんどが明らかになっていない。最近、我々を含めた研究グループにより微生物由来のGDHが非常に多様で複雑に調節されている可能性が示されてきた。本研究では微生物GDHの多様な調節機構を探索し、代謝調節の分子基盤を明らかにすることを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

グルタミン酸脱水素酵素GDHはグルタミン酸と2-オキソグルタル酸の可逆的変換を触媒する酵素であり、ほとんど全ての生物において炭素・窒素代謝の恒常性の維持において重要な役割を果たしている。我々は以前に好熱菌Thermus thermophilus由来のGDH (TtGDH)が複雑なアロステリック活性化を受けることを発見した。本研究では、このGDHの活性化の構造基盤を明らかにする共に、別の微生物のGDHにおける新奇活性調節機構を探索し、細胞内機能を解明することを目指した。
TtGDH複合体のクライオ電顕解析を行い、3.6Å分解能のデータを得た。最終年度はこのデータに基づき各コンポーネントの間の相互作用部位の変異体解析を行った。その結果、これらのタンパク質の間の特定のイオン結合が相互作用の鍵となっていることが明らかとなった。
また、我々は分裂酵素の2種類のGDHに着目した。そのうち一つのSpGDH1はNADPH依存型酵素である。我々は、SpGDH1の補酵素・基質複合体の結晶構造を決定し、補酵素認識機構を明らかにした。SpGDH1の補酵素特異性はリン酸化修飾により制御されている可能性が考えられた。リン酸化模倣変異体を解析したところ、補酵素特異性がシフトしていることがわかった。最終年度では、分裂酵母内で実際にSpGDH1がリン酸化されていることを確認するために、分裂酵母の組換え株を作製した。
他方のSpGDH2はサブユニットのサイズが約115 kDaと大きいタイプのGDHである。コアGDHドメインの他に大きな機能未知ドメインを有していることなどから、複雑な調節機構が存在することが予想された。大腸菌を用いてSpGDH2の組換えタンパク質を調製し、その酵素活性を確認した。最終年度では、クライオ電顕解析により3.6Å分解能のデータを得て複雑なドメイン構造を形成していることが明らかになった。

Research Products

• [Presentation] 高度好熱菌Thermus thermophilus由来アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼとそのホモログの結晶構造解析による触媒機構と機能分化様式の解明 (2022)
  • Author(s): 富田武郎、西山真
  • Organizer: 日本農芸化学会 2022年度大会
• [Presentation] 高度好熱菌Thermus thermophilus由来アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼとそのホモログの結晶構造解析による触媒機構と機能分化様式の解析 (2022)
  • Author(s): 富田 武郎, 西山 真
  • Organizer: 日本農芸化学会2022年度大会
• [Presentation] 高度好熱菌Thermus thermophilusのグルタミン酸脱水素 酵素における酵素ホモログとの相互作用を介したアロステ リック調節機構 (2021)
  • Author(s): 富田武郎
  • Organizer: 極限環境生物学会2021年度 (第22回) 年会