| Project/Area Number |
21K05365
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
藤江 誠 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 准教授 (20274110)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川崎 健 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 助教 (00510299)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2024: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2023: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2022: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | ナンノクロロプシス / ゲノム編集 / 脂質生産 / CRISPR-Cas9 / 炭酸脱水素酵素 / ジーンタギング / carbonic anhydrase / Nannochloropsis / バイオ燃料 / Crispr-Cas9 / クリソラミナリン / RNP / 微細藻類 / 代謝機能 |
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| Outline of Research at the Start |
微細藻類によるバイオ燃料生産の実用化には、増殖特性や脂質の生産性に優れた藻類株の分子育種が基盤技術として必要である。生産現場では解放系での培養となるため、組換えDNA技術を用いない育種技術が必要である。本研究は、代表的な油脂生産藻類であるナンノクロロプシス類（Nannochloropsis)の代謝機能を超効率化するために、(1) CO2濃縮機構の改変による高濃度CO2耐性株の創出、 (2) ジーンタギングによる脂質合成系遺伝子群の網羅的検出と機能解析、 (3)ナンノクロロプシスにおける組換えDNA技術を用いないゲノム編集システムの確立、を目標とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
①2021年度までの研究で、ナンノクロロプシスのCarbonic Anhydraseをゲノム編集で改変し、 光合成能力と増殖特性の変化を解析してきた。CA3遺伝子について、CA3遺伝子の１アミノ酸置換株の取得に成功した。その生理特性を解析したところ高濃度のCO2通気に対して明確な耐性を示した。2022年度に取得した酸素電極型光合成解析装置で解析したところ光合成能力が強化されている可能性が示された。この変異がゲノム編集によることを確認するために、野生型遺伝子による相補を試みている。当初計画に加えて、C代謝のsink側に位置するUDP-Glucose合成遺伝子の破壊を試み、２種類のUDP-Glucose合成遺伝子をゲノム編集で破壊した。これらの破壊株の脂質蓄積能力を細胞生物学的な手法で解析したところ脂質蓄積が強化された可能性が示された。 ② マイクロプレートを用いてナンノクロロプシスを培養し、培養液を蛍光染色して細胞中の脂質含有量を蛍光プレートリーダーで高速定量する実験系を確立した。また、１回の形質転換で10,000株以上の規模のタギングライブラリーが構築可能になった。構築したライブラリーについて細胞中の脂質を蛍光染色することで、脂質含量変異株のスクリーニングを進めている。 ③ゲノム編集株のポジティブセレクションマーカー遺伝子として、FOAによるポジティブセレクションを可能とするorotidine-5-phosphate decarboxylase、及び、2-FAによるポジティブセレクションを可能とするアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT） の破壊を2021年度に継続して試みた。どちらも耐性コロニーの取得に成功したが、ほぼ全ての耐性株でゲノム編集は確認されず、スポンテニアスな変異で耐性が出現したと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①carbonic anhydraseに関する研究では、高濃度の二酸化炭素に耐性株の取得に成功し、解析を進めている。また脂質合成に関与するUDP-Glucose合成遺伝子のゲノム編集株を作成した。この株を解析したところ脂質蓄積能力が向上した可能性が示されている。
②マイクロプレートを用いた脂質蓄積に関する変異体の取得に関しては、培養条件・染色条件を改善し96穴プレートで大量解析可能な実験系を確立した。計画に従ってタギングライブラリーを用いて脂質合成変異株のスクリーニングを進めている。
③ポジティブセレクション系の確立にはいたっていないが、代替としてRNPを直接導入してゲノム編集する系の構築に成功した。2022年度においては、ノックイン株の取得にも成功している。
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| Strategy for Future Research Activity |
①CA3変異株に関しては、光合成能力（酸素発生能力）を測定し、野生株と比較解析を進める。変異株に野生型のCA3遺伝子を導入して相補し、高濃度CO2耐性がCA3変異によることを確認する。UDP-Glucose遺伝子破壊株については、バイオマスあたりの脂質含有量とクリソラミナリン量を定量し、ゲノム編集により脂質高生産株を作出したことを確認する。②マイクロプレートを用いた培養・アッセイ系によるスクリーニング系を用いて、脂質合成変異株を取得する。③RNPの直接導入によるゲノム編集系の確立を目指す。
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