α-グルカンオリゴ糖配糖体合成プラットフォームの創製

• Project/Area Number: 21K05366
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38020:Applied microbiology-related
• Research Institution: Osaka Metropolitan University (2022-2023); Osaka Prefecture University (2021)
• Principal Investigator: 炭谷 順一 大阪公立大学, 大学院農学研究科, 准教授 (10264813)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2021: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: マルトトリオース / 配糖体 / 糖転移反応 / α-アミラーゼ / アミラーゼ

Outline of Research at the Start

天然には有用な生理活性を有するものの，強いにおいや刺激を持っていたり，水溶性や安定性に乏しかったりすることで利用できない多くの化合物が存在する。配糖体化することで，化合物の溶解性，安定性，吸収性および味質などが改変されることが知られている。本研究ではデンプンをマルトトリオース単位に切断するとともに化合物に結合して配糖体を合成するアミラーゼについて，変異酵素を用いた生化学的解析とX線結晶構造解析を用いた構造生物学的アプローチによって基質認識や糖転移活性に関する分子基盤を明らかにするとともに，特定のα-グルカンオリゴ糖配糖体合成のためのプラットフォームの創製を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

天然には有用な生理活性を有するものの，強いにおいや刺激を持っていたり，水溶性や安定性に乏しかったりすることで利用できない多くの化合物が存在する。そのような化合物に糖を結合させて配糖体とすることで，化合物の溶解性，安定性，吸収性および味質などが改変されることが知られている。我々は土壌から分離した放線菌MK-1785株がデンプンを非還元末端側からマルトトリオース（G3) 単位で分解するとともに，生成するG3を水酸基含有化合物に転移し配糖体を合成することが可能なα-アミラーゼ(G3Amy)を生産することを見いだした。本研究では，X線結晶解析を用いた構造生物学的アプローチと変異酵素を用いた酵素化学的アプローチを組み合わせて，本酵素の基質認識や糖転移に関する分子基盤を解明することを目的としている。また，その成果を基に糖転移活性をさらに高めたり糖受容体特異性を改変したりすることで，特異な生理活性を有するG3配糖体の合成プラットフォームを創製することを目指している。
今年度はG3Amyと触媒ドメイン内で95％のアミノ酸が一致するKitasatospora cineracea由来オルソログ酵素（KcAmy1）においてG3特異性がなく，通常のα-アミラーゼと同様にランダムにデンプン鎖を分解することが判明した。そこで，同酵素に対してN192Q変異を導入し電気泳動的に均一に精製し，宿主酵素の影響を排除したサンプルを用いてG3特異性を確認したところ，N192Q変異酵素の反応産物としてG3のみ検出されることが確かめられた。しかし過剰に反応させることで僅かなG1やG2が検出されることが判明し，同変異酵素について定量的に解析する必要性が生じた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度もG3Amyとidentityが高いKcAmy1が，G3特異性は観察されず通常のα-アミラーゼと同様のデンプン鎖をランダムに加水分解する酵素であったことから，G3AmyとKcAmy1の触媒ドメイン内でアミノ酸残基が異なる23か所の中で，以前G3AmyでG3特異性に大きく関与している可能性が示されたN134とQ192のうち，N134はKcAmy1でも保存されているものの，Q192はN192となっており，N192Q変異を導入した変異酵素がG3特異性を示すことを確認した。しかし，過剰に反応させることでG1やG2が反応産物として検出されたことから，定量的に解析する必要が生じている。今年度は実験を担当する学生の都合がつかず，あまり研究を進めることができなかった。

Strategy for Future Research Activity

次年度は最終年度として，KcAmy1-N192Qの各種マルトオリゴ糖に対するカイネティックパラメーターを測定し，サブサイト親和力について考察することで，KcAmy1のG3特異性について定量的な評価を行い，G3特異性に重要な役割を果たしていると想定しているN134とQ192の役割について明らかにする。また，本研究の第一の目的である，加水分解反応と糖転移反応の分水嶺となるアミノ酸残基とその分子機構について明らかにするために，F258およびP259を含むループ構造を中心に，変異酵素を作製し，加水分解活性と糖転移活性を評価することで変異部位のアミノ酸の役割を明らかにする。G3AmyとBacillus sp. 1011由来CGTaseの立体構造を重ね合わせたところ，本ループ領域が内側にずれることで，acid/baseであるE256の位置がnucleophileであるD225から約5.0Åも離れる結果となっており，このことが加水分解を即座に進行させない原因になっているものと考えられた。糖受容体となる化合物がサブサイト+1部位に侵入することで，F258が動き，E256が適切ない位置取りを取ることが可能となり，糖転移反応が進行するものと考えられるため，E256の位置が変化するような変異酵素を設計し，それらの加水分解活性と糖転移活性について検討し，F258が位置するループの反応を進行させるためのスイッチとしての役割を明らかにしていく予定である。
また，L191R変異酵素の糖転移活性が上昇した結果が得られているが，この部位はCGTaseにおいて環化反応や糖転移反応に重要な役割を果たしている保存された４つの芳香族残基のうちのひとつが位置する場所となっている。そのため，芳香族アミノ酸に置換することで糖転移活性にどのような影響が生じるのかについても検討する。