Exploring novel glucosidase for glucoside synthesis and the characterization.

• Project/Area Number: 21K05374
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38020:Applied microbiology-related
• Research Institution: Oyama National College of Technology
• Principal Investigator: 上田 誠 小山工業高等専門学校, 物質工学科, 教授 (10615751)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹内 道樹 京都大学, 農学研究科, 特定助教 (40766193) ; 原 良太郎 京都大学, 農学研究科, 特定准教授 (70553535)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2021: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 配糖体 / β-グルコシド結合 / β-グルコシダーゼ / 糖転移反応 / 微生物 / グルコシダーゼ / アノマー / 微生物変換 / 転移反応

Outline of Research at the Start

ポリフェノールなどの配糖体は食品や医薬品分野等で広く使われ、各種の化合物の配糖体合成法が研究されている。特に、酵素の糖転移反応によるα-配糖体合成は効率が良い。一方、β-配糖体については、高収率かつ高生産な合成手法の報告は無い。薬用植物や医薬の活性成分としてβ-配糖体は有用であり、新しい合成反応の開発が期待されている。申請者は酵素の多様性に基づいた糖転移反応によるβ-グルコシド配糖体合成に着目し、数種の微生物から新規なβ-配糖化活性を見出した。そこで本研究では、β-配糖体を優位に合成できる酵素の探索と性質解明を進め、β-配糖体の高収率・高生産な合成法の開発と酵素の反応機構の解明を目的とする。

Outline of Annual Research Achievements

〇Agrobacterium sp. No.201の反応条件検討
Agrobacterium sp. No.201の洗浄菌体に, 5, 10, 20, 30, 50, 100 g/Lのセロビオース, 7 g/Lの2-フェニルエタノールを含むリン酸緩衝液 (20 mM KPB, pH7.0) を加え、インキュベーターで190rpm, 30℃で96時間反応させた。メタノールで反応を停止後, HPLCで配糖体の蓄積量を測定した。2-フェニルエタノール-β-D-グルコシド合成反応のセロビオース濃度依存性を検討した。また、Agrobacterium sp. No.201の洗浄菌体に, 1, 3, 5, 7, 9 g/Lの2-フェニルエタノール, 100 g/Lセロビオース溶液を含むリン酸緩衝液 (20 mM KPB, pH7.0)を加え, インキュベーターで190rpm, 30℃で96時間反応させた。メタノールで反応を停止後, HPLCで配糖体の蓄積量を測定した。2-フェニルエタノール-β-D-グルコシド合成反応の2-フェニルエタノール濃度依存性を検討した。配糖化反応の検討は、セロビオースを主炭素源とした培養液から調整した洗浄菌体に基質を添加することで行った。生成配糖体の定性・定量はTLC, HPLCを用いた。生成したフェネチルアルコール配糖体は、分離精製し、NMR及びLC-MSにて構造解析を行った。これらの結果から、Agrobacterium sp. No.201は、基質フェネチルアルコールに対し高い単糖配糖体の合成活性を示した。また、NMRによる構造解析の結果、フェネチルアルコール-β-D-グルコピラノシドであることを確認した。反応温度、基質濃度の検討を行ったところ、7 g/Lフェネチルアルコール、100 g/Lセロビオース, 40℃での合成において、モル収率15.2%であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通りβ配糖体の合成活性を持つ微生物を探索し、効率的な変換を可能とした。今後は活性株の酵素の性質と性質解明をすすめる予定である。

Strategy for Future Research Activity

取得した微生物から、酵素の性質解明と配糖体の蓄積検討を行う。今年度末から外部発表（学会や論文）を行う予定であり、産業的な有効性も判断し、特許出願を検討する。