Development of D amino acid derivative synthetic method by ancestral L-amino acid oxidases
| Project/Area Number |
21K05395
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
中野 祥吾 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 准教授 (80748541)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | 祖先型再構成法 / L-アミノ酸酸化酵素 / 物質生産 / X線結晶構造解析 / 祖先型設計 / 光学分割 / D-アミノ酸 / D-アミノ酸合成 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、広基質選択性を有するL-アミノ酸酸化酵素 (AncLAAO) を研究対象とし、本酵素を用いたD-アミノ酸誘導体の微生物生産系の構築に取り組む。AncLAAOの高機能化 (耐熱性と耐久性の向上)、構造機能解析による本酵素の基質認識機構の解明と合理的変異導入による基質選択性改変を実現、L-アミノ酸誘導体をD体へと変換可能な本酵素を軸とする微生物生産系の構築を行う。本研究が完遂されることで、様々なD-アミノ酸誘導体を高純度かつ大量に合成することが可能となり、ペプチド医薬品を含むファインケミカル合成への貢献が期待される。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2022年度に取得したHTAncLAAO2について、分子置換法による位相決定と構造精密化を実施し、その構造を2.2Å分解能にて決定した。得られた構造は手裏剣状の8量体構造を形成しており、これはクライオ電子顕微鏡 (ネガティブ染色法) およびゲル濾過クロマトグラフィー法による分子量測定の結果と一致していた。このような特徴的な多量体構造が形成されることで、HTAncLAAO2の極めて高い耐熱性・安定性が獲得されたと考えられる。続いて酵素学的諸性質を検討した結果、本酵素は4種類の疎水性L-アミノ酸 (L-Phe, L-Leu, L-IleおよびL-Met) に高い活性を示すことが判明した。一方でL-Trpといった嵩高いL-アミノ酸に対して活性は低かった。そこで基質認識に関わるアミノ酸残基 (W220, L320, およびY383) を特定し、この部位をAlaに置換することで、L-Trpに高い活性を示す変異体の作成を行った。結果W220A変異体について、変異導入前に比べてkcat/Kmの値が一桁ほど改善することを明らかにした。続いて取得したHTAncLAAO2(W220A)変異体を用いた、化学-酵素法によるD-Trp誘導体の合成系構築を目指した研究を実施した。アンモニア-ボラン錯塩を還元剤として用いた反応条件下で、３種類のD,L-Trp誘導体 (5-フルオロ, 5-メトキシ, 7-フルオロTrp) について、高い光学純度 (>99% ee) かつ単離収率 (>53%) でD体を合成することに成功した。本成果は論文として既に報告している (Communications Chemistry, 2023, 6, 200)。
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Report
(3 results)
Research Products
(26 results)
