| Project/Area Number |
21K05396
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University (2022-2023)
Osaka City University (2021) |
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Principal Investigator |
伊藤 和央 大阪公立大学, 大学院理学研究科, 准教授 (20183171)
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| Project Period (FY) |
2021-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 生体認識配糖体 / エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ / 立体構造 / ドメイン / マルチドメイン構造 / エンド‐β‐N‐アセチルグルコサミニダーゼ / 糖鎖組換え / バイオ医薬品 |
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| Outline of Research at the Start |
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼHS(エンドHS)は、糖タンパク質からコンプレックス型のアスパラギン結合型糖鎖を特異的に遊離し、これを様々な化合物に転移する唯一の酵素である。
エンドHSのＸ線結晶構造解析で明らかとなった新規ドメイン群の機能解析を通じて、本酵素の触媒部位と糖鎖認識部位を解明する。触媒部位の改変し、糖鎖加水分解型から糖鎖転移合成型酵素へと機能変換し、生体認識配糖体生産への実用化を目指す。
抗体医薬品などのバイオ医薬品の糖鎖構造均一・最適化への利用を目指す。
糖鎖認識部位を改変し、様々な構造のアスパラギン結合型糖鎖を付加した生体認識配糖体合成酵素を創生する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
2021～2022年度は、野生型エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(エンド)HS(Wild)とC末端側欠失型エンドHS(DM-1～DM-6)の発現系を構築し、ヒトトランスフェリン(HTF)からの二本鎖コンプレックス型糖鎖遊離活性を調べた。それぞれのアミノ酸領域は、Wild(30～1009)、DM-1(30～966)、DM-2(30～906)、DM-3(30～883)、DM-4(30～861)、DM-5(30～811)、DM-6(30～708)であった。本酵素のドメインI～VのうちドメインVを一部または全欠失したDM-1とDM-2は、野生型酵素と同程度の活性で、ドメインIVを部分欠失したDM-3とDM-４および全欠失したDM-6は活性を示さなかった。野生型と各欠失型酵素は、ウシRNase Bのハイマンノース型糖鎖を遊離しなかった。ドメインVは活性発現に不必要でドメインIVは必須であった。触媒部位はドメインIに存在するため、ドメインIVは糖鎖特異的認識・結合に関与すると考えられた。
本年度は、ドメインIV～VとドメインVおよび触媒能のない二重置換変異エンドHS(E218Q/Y252F)の発現系を構築し、各発現体とHTFとの結合能をゲルシフトアッセイ法で解析した。ドメインIV～VとドメインVはHTFとの結合性を示さなかった。エンドHS(E218Q/Y252F)はHTFと結合し脱糖鎖HTFとは結合せず、糖鎖を介して結合した。エンドHS(E218Q/Y252F)は各種構造のコンプレックス型糖鎖を有するヒトラクトフェリン、ウシフェツイン、ヒトα1-酸性糖タンパク質と結合したが、ハイマンースまたはハイブリッド型糖鎖を有すオボアルブミンとは結合しなかった。遊離のドメインIVは糖鎖結合性がないが、エンドHS構成ドメインとして存在すると糖鎖特異的認識・結合性を示すと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、コロナ禍のため研究時間が制限され、予定していた研究をすべて行うことができなかった。しかし、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ（エンド）HSのドメインIV～VとドメインVおよび触媒能を失った二重置換エンドHS(E218Q/Y252F)の発現系を構築し、発現体を得ることができた。そして、これらの発現体と二本鎖コンプレックス型糖鎖を有するヒトトランスフェリン(HTF)との結合性をゲルシフトアッセイ法で解析することができた。
その結果、ドメインIV～VとドメインVはHTFとの結合性を示さなかった。一方、触媒機能のないエンドHS(E218Q/Y252F)はHTFとの結合性を示し、糖鎖を除去したHTFとは結合せず、糖鎖を介して結合していることを明らかにできた。エンドHS(E218Q/Y252F)は各種構造のコンプレックス型糖鎖を有する他の糖タンパク質と結合し、ハイマンースあるいはハイブリッド型糖鎖を有すオボアルブミンとは結合しないことを明らかにした。そして、ドメインIVは、単独では糖鎖との結合性がないが、エンドHSを構成するドメインとして存在するとコンプレックス型糖鎖との特異的結合に関与することを明らかにできた。
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| Strategy for Future Research Activity |
野生型エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼ(エンド)HS、欠失変異型エンドHS、二重置換変異エンドHS(E218Q/Y252F)発現条件をもとに、各変異酵素を大量発現しこれらを精製する。精製した各変異型エンドHSを用いて、変異酵素と糖鎖との分子間相互作用を解析する。さらに、ドメイン間のループ構造部分を特異的プロテアーゼで加水分解し、各ドメイン欠失エンドHSを調製し、同様の解析を行う。こうして各ドメインの機能を明らかにする。
また、得られ欠失変異型エンドHSの結晶を調製し、X線結晶構造解析を行い、欠失変異型エンドHSの立体構造とその糖鎖構造特異性との関係から、エンドHSのドメインの機能を明らかにする。あわせてクライオ電子顕微鏡によって立体構造を解析する。
さらに、基質糖タンパク質と二重置換変異エンドHS(E218Q/Y252F)と複合体を分離・精製し、X線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡によって複合体の立体構造を明らかにする。また、糖ペプチドと欠失変異型エンドHSとの共結晶を調製し、X線結晶構造解析によってエンドHS・基質複合体の立体構造を明らかにする。そして、触媒および糖鎖認識関与するアミノ酸残基を特定し、各ドメインの機能を解明する。
エンドHSのドメイン解析から特定した加水分解・糖鎖転移に関わるアミノ酸残基を置換し糖鎖転移合成型エンドHSに改変し、ヘスペリジンおよびブレオマイシンに糖鎖を転移導入する。糖鎖結合ヘスペリジンおよびブレオマイシンのマウス肝臓への特異的移行を調べる。また、糖鎖転移合成エンドHSを用いて抗リウマチ抗体医薬品トシリズマブなどのバイオ医薬品の糖鎖を入替えと糖鎖構造最適化を検証する。
さらに、エンドHSの構成ドメインをハイマンノース型糖鎖特異的エンドFV遺伝子に挿入し、ハイブリッドエンドFVの糖鎖構造特異性を調べ、ドメインの機能を検証する。
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