比較ゲノミクスから探る育種モデル食用菌の生殖成長相転換機構の全容解明

Research Project

Project/Area Number	21K05530
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 39010:Science in plant genetics and breeding-related
Research Institution	Kindai University
Principal Investigator	種坂英次近畿大学, 農学部, 教授 (80188391)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	築山拓司近畿大学, 農学部, 准教授 (00423004) 白澤健太公益財団法人かずさDNA研究所, 先端研究開発部, 主任研究員 (60527026)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000) Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2021: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
Keywords	エノキタケ / 子実体形成関連遺伝子 / 機能解析 / 過剰発現 / 遺伝子ターゲティング / 育種モデル菌 / 子実体形成不全株 / 低温刺激 / 発現解析 / 子実体形成 / 比較ゲノミクス / トランスクリトーム解析
Outline of Research at the Start	本課題では、エノキタケの子実体形成不全を示す変異株を供試材料として、①子実体形成不全を引き起こす変異核の同定、②子実体形成不全株と野生株の比較ゲノム解析、③フラスコ内での子実体形成発現系を用いたRNA-seq解析による、子実体形成関連候補遺伝子の同定、④食用担子菌における栄養成長から生殖成長へのマスタースイッチを含む転換機構の全容解明を目的とする。本研究の成果は、担子菌類の生殖成長への転換機構を解明するのみならず、栽培菌における発茸処理のタイミングを含む栽培管理、変異発生の少ない安定した栽培品種の育成についての基礎的知見を与え、食用菌においてもゲノム編集による育種の道を拓く。
Outline of Annual Research Achievements	昨年度までに、エノキタケの子実体形成株（正常株n）および子実体形成不全株（変異株d3, d4, d5）について、フラスコ内での子実体形成系を構築した。また、RNA-seq解析から、正常株の子実体形成期に特異的に発現する2つの遺伝子、Fv.FDS（Flammulina development specific gene）およびハイドロフォビンFv.hyd1を子実体形成関連遺伝子として特定した。 2022年度はこれらの遺伝子の機能解析を目的として、FDS過剰発現株とノックアウト系統の作出を実施した。プロトプラスト-PEG法によって、変異株d3にFDS過剰発現カセットを導入した形質転換体Td3を作出した。Td3ではフラスコ内での子実体形成は観察できなかったものの、オガクズを含む菌床培地では正常株と同様に子実体を形成したことから、FDSは子実体形成に大きく関与する遺伝子であることを示した。一方、ノックアウト系統の作出においては遺伝子ターゲティング効率を減少させる非相同末端結合遺伝子の破壊に着手した。単核性発茸系統についてプロトプラスト-PEG法で非相同末端結合遺伝子Fv.LigIVの破壊用コンストラクトを導入した。形質転換後、ハイグロマイシンを含む選択培地に出現したコロニーを分離した。得られたFv.LigⅣ 破壊候補系統について、UV照射した菌糸体からRNAを抽出し、RT-PCRにてFv.LigⅣの発現確認を行った。その結果、一次スクリーニングで得られた904系統のうちの1系統においてFv.LigⅣ の破壊をゲノムレベルで確認するとともに、RT-PCRによりFv.LigⅣ 発現のノックアウトを確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason RNA-seq,解析で得られた子実体形成関連遺伝子の機能解析として、① Fv.FDS過剰発現株の表現型解析を実施するとともに、② ノックアウト系統作出に向けて相同組換えを利用した遺伝子ターゲティングを実施し、非相同末端結合関連遺伝子Fv.LigIVの破壊系統を作出した。ここでの遺伝子ターゲティング頻度は約0.11％（1/904）であったことから、エノキタケは子嚢菌類のAspergillusやNeurosporaと同様に非相同末端結合をDNA修復の主要経路としていることを明らかにした。
Strategy for Future Research Activity	変異株d3で得られた形質転換体Fv.FDS過剰発現株の表現型（子実体形成のレスキュー）について、他の変異株de4, d5および単核性非発茸系統への導入を実施し、さらにFv.hyd1過剰発現株の解析も進める。一方、単核性発茸系統で得られたFv.LigIV破壊系統を用いて、Fv.FDSやFv.hyd1の遺伝子ターゲティングによるノックアウトと表現型解析を実施する。以上の結果から、子実体形成に関わる遺伝子群の相互の役割について検討する。