Construction of artificial chromosomes using silkworm chromosomes with holocentric kinetochores

Research Project

Project/Area Number	21K05617
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 39050:Insect science-related
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	門宏明九州大学, 農学研究院, 准教授 (30616412)
Project Period (FY)	2021-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2023: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000) Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000) Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Keywords	分散型動原体 / カイコ / 人工染色体 / DNA複製起点 / セントロメア
Outline of Research at the Start	カイコ染色体の特徴を利用し、効率よく細胞内で維持可能な人工染色体の構築を目指す。カイコは、１本の染色体上に多数のセントロメア領域（分散型動原体）を有しており、そのため、カイコ細胞内で分断された染色体断片が世代間においても安定に維持される。染色体末端はテロメア反復配列とレトロトランスポゾンにより構成されている。これらカイコに特徴的な染色体構造を利用し、長期間にわたり安定的に細胞内で維持される人工染色体の作製を目的とする。
Outline of Annual Research Achievements	本申請では、カイコ染色体の特徴（分散型動原体、反復配列とレトロトランスポゾンによるテロメア）を利用し、効率よく細胞内で維持可能な人工染色体の構築を目的としている。細胞外から導入されたDNAが、細胞内に長期間維持されるには、効率の良いDNA複製と分配が必要である。そのためには、DNA複製起点、セントロメアと動原体タンパク質複合体、テロメアが必要なエレメントである。① DNA複製起点を含むDNA断片の単離、② 動原体タンパク質をBac DNA上に局在化させることによるDNA分配効率の向上を試みている。昨年度に引き続き本年度も、DNA上に動原体タンパク質複合体を局在化させる技術開発、および、カイコ細胞内で効率よく複製する複製起点を含むDNA断片の単離のための技術基盤の整備を行った。まず、カイコ細胞内でDNAを長期間維持させるのに必要なエレメントをもつ長鎖環状DNAを、効率よくin vitroで構築するために、Golden gate法を用いることにした。この方法では、~ 10 kbp程度のエレメントをそれぞれプラスミドを作製しておき、様々な組み合わせで酵素反応させることにより、簡便に効率よく様々な種類の長鎖環状DNAを作製可能になる。そのためのベクター系のシステムを作成し、~ 100 kbp程度の長鎖DNAが構築可能になった。また、動原体タンパク質を長期間、細胞内で発現させると発現量の低下がみられたため、ヒトFKBP12、および、大腸菌dihydrofolate reductase (ecDHFR)タグを使用して、可逆的に細胞内のタンパク質量を制御可能なシステムも構築した。動原体タンパク質をDNA上に局在化するために、dCas9を使用して目的タンパク質を染色体上に局在化することができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 申請時に予定していた実験系の構築において、いくつか変更が生じたが、それに対応する実験系の構築により対処できた。特に、長鎖環状DNAは、ベクター側の改変を行うためには、その都度大腸菌内で遺伝子組み換えにより編集を行う必要があるが、Golden gate法により数断片をin vitroで組み上げるシステムを構築したので、来年度から行う複数のコンストラクトを簡便に構築できるようになった。
Strategy for Future Research Activity	次年度は、引き続きベクターの改良を行いつつ、細胞内でDNAを長期間維持させるのに必要なエレメント（DNA, 動原体タンパク質）の同定を試みる。