Establishment of Lentinula edodes genome editing technology and analysis of genes related to preservation of fruiting body

• Project/Area Number: 21K05700
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 40020:Wood science-related
• Research Institution: Kitami Institute of Technology
• Principal Investigator: Sato Toshitsugu 北見工業大学, 工学部, 教授 (00390881)
• Project Period (FY): 2021-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2021: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: シイタケ / ゲノム編集 / CRISPR/Cas9 / RNP / 胞子 / sgRNA / ドナーベクター / Cas9 / lcc1 / 保存性 / １核菌糸 / 子実体保存性関連遺伝子

Outline of Research at the Start

本研究では、シイタケのゲノム編集技術を確立し、最終的に日持ちのよいシイタケを得ることを目的とする。具体的には、初めにシイタケの胞子を採取し、遺伝子導入しやすい株を選抜する。選抜した胞子株は、交配可能な株に分類する。次に、それら株を用いて、遺伝子を破壊するゲノム編集方法を確立する。その後、シイタケの保存性に関与する遺伝子を実際に破壊し、これらの遺伝子の機能を解析し、最終的に実用化可能な株を得る。

Outline of Final Research Achievements

In Lentinula edodes, genome editing technology by Cas9 protein-gRNA complex (RNP) has not yet been established. In this study, we examined the conditions for spore preservation, and also the design of sgRNAs for the sdc-ip and lcc1 genes and the construction of donor vectors for each gene modification in order to establish genome editing by RNPs. As a result, it was revealed that spores with a germination rate of approximately 3% immediately after collection from fruiting body could maintain a germination rate of 1% for 60 days at -80°C. We also constructed donor vectors to convert the sdc-ip gene in L. edodes to cbx, which confers carboxin resistance by artificial single nucleotide substitution, and to replace the lcc1 gene with cbx to destroy the lcc1 gene.

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

本研究では、シイタケではいまだに確立されていない、外来遺伝子を細胞に残さないCas9タンパク質gRNA複合体（RNP）によるゲノム編集技術を確立することを目的としている。この技術の確立は、遺伝子組換え体とならない実用化可能なシイタケの育種技術となるため、学術的にも社会的にも意義がある。

Research Products

• [Journal Article] Development of a gene-targeting system using CRISPR/Cas9 and utilization of pyrG as a novel selectable marker in Lentinula edodes. (2023)
  • Author(s): Kamiya A, Ueshima H, Nishida S, Honda Y, Kamitsuji H, Sato T, Miyamoto H, Sumita T, Izumitsu K & Irie T
  • Journal Title: FEMS Microbiol Lett Volume: 370 Pages: 1-6
  • DOI: 10.1093/femsle/fnad042
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] シイタケの遺伝子導入研究 (2021)
  • Author(s): 佐藤利次
  • Journal Title: きのこ研だより Volume: 44
• [Presentation] シイタケにおけるダブルニッキング法を用いたゲノム編集 (2023)
  • Author(s): 冨士元みゆ、吉澤懐、神谷彩音、稲垣翔太、本田与一、佐藤利次、上辻久敏、泉津弘佑、住田卓也、入江俊一
  • Organizer: 第74回日本木材学会大会
• [Presentation] シイタケにおけるnon-GM型遺伝子ターゲティング系の開発 (2023)
  • Author(s): 鳴瀧拓馬、辻本悠馬、神谷彩音、西田翔太、本田与一、佐藤利次、上辻久敏、泉津弘佑、住田卓也、入江俊一
  • Organizer: 第74回日本木材学会大会
• [Presentation] CRISPR/Cas9を用いた相同組換えによるシイタケpyrGの破壊と選択マーカー遺伝子としての利用 (2023)
  • Author(s): 神谷彩音、上島拓輝、本田与一、佐藤利次、上辻久敏、西田翔太、稲垣翔太、泉津弘佑、住田卓也、入江俊一
  • Organizer: 23年度木材学会
• [Presentation] CRISPR/Cas9発現カセットの一時的導入によるシイタケPyrGの相同組換え (2022)
  • Author(s): 神谷彩音、上島拓輝1、本田与一、佐藤利次、上辻久敏、西田翔太、稲垣翔太、泉津弘佑、住田卓也、入江俊一
  • Organizer: 22年度日本菌学会
• [Presentation] シイタケ子実体関連遺伝子exp1の解析 (2022)
  • Author(s): 坂本 郁生、大畑 早弥香、橋本 侑香、吉田 一生、佐藤 利次
  • Organizer: 日本農芸化学会
• [Presentation] ラッカーゼ発現に変異が生じたシイタケ組換え体のラッカーゼ遺伝子の解析 (2022)
  • Author(s): 鈴木 未由太、野地岡 侑輝、佐藤 利次
  • Organizer: 日本農芸化学会